牛凝乳酶原基因的定点突变与酶性质研究
| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩写词 | 第8-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-24页 |
| ·干酪的营养价值和发展前景 | 第12-13页 |
| ·凝乳酶的结构及其凝乳机理 | 第13-15页 |
| ·凝乳酶的结构 | 第13-14页 |
| ·凝乳酶的凝乳作用 | 第14-15页 |
| ·凝乳酶替代品 | 第15-17页 |
| ·重组凝乳酶的原核表达 | 第17页 |
| ·重组凝乳酶的真核表达 | 第17-21页 |
| ·本项试验研究的内容和意义 | 第21-24页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第24-40页 |
| ·实验材料 | 第24-27页 |
| ·菌株和载体 | 第24页 |
| ·主要工具酶和仪器 | 第24-25页 |
| ·试剂和培养基 | 第25页 |
| ·培养基配方 | 第25-26页 |
| ·主要缓冲液配方 | 第26页 |
| ·蛋白质电泳试剂 | 第26页 |
| ·PCR 引物 | 第26-27页 |
| ·重组质粒构建的方法 | 第27-31页 |
| ·引物设计 | 第27-28页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第28页 |
| ·PCR 产物纯化 | 第28页 |
| ·DNA 片段和载体的连接 | 第28-29页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| ·质粒DNA 的转化 | 第30页 |
| ·菌液PCR | 第30页 |
| ·质粒DNA 的提取 | 第30-31页 |
| ·双酶切鉴定重组载体 | 第31页 |
| ·凝乳酶基因定点突变的方法 | 第31-32页 |
| ·凝乳酶基因定点突变的引物设计 | 第31页 |
| ·凝乳酶基因定点突变的PCR 反应 | 第31-32页 |
| ·突变体的验证 | 第32页 |
| ·凝乳酶基因的表达 | 第32-34页 |
| ·重组质粒pKLAC1-Prochy 的构建 | 第32页 |
| ·线性化质粒DNA 制备 | 第32-33页 |
| ·乳酸克鲁维酵母感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·酵母电转化 | 第33页 |
| ·重组子的筛选 | 第33-34页 |
| ·酶活性的测定 | 第34页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 电泳检测 | 第34-36页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶的灌制 | 第34-35页 |
| ·加入样品 | 第35页 |
| ·电泳 | 第35页 |
| ·凝胶的染色及脱色 | 第35页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第35-36页 |
| ·凝乳酶纯化的方法 | 第36-37页 |
| ·样品预处理 | 第36页 |
| ·柱料处理 | 第36页 |
| ·装柱 | 第36-37页 |
| ·离子交换层析 | 第37页 |
| ·凝胶过滤层析 | 第37页 |
| ·酶促反应动力学 | 第37页 |
| ·温度和pH 对酶活性的影响 | 第37-40页 |
| 第三章 实验结果与分析 | 第40-56页 |
| ·重组菌株的构建 | 第40-42页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第40页 |
| ·重组菌株的构建 | 第40-42页 |
| ·定点突变的结果分析 | 第42-45页 |
| ·凝乳酶的纯化 | 第45-50页 |
| ·层析结果 | 第45-46页 |
| ·纯化分离效果 | 第46-47页 |
| ·重组菌株表达产物的SDS-PAGE 电泳分析 | 第47-48页 |
| ·凝乳酶Km 和Vmax 的测定 | 第48-50页 |
| ·凝乳酶的最适反应温度和pH | 第50-51页 |
| ·讨论 | 第51-54页 |
| ·研究总结 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62-64页 |
| 硕士期间发表论文 | 第64-65页 |
