| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略词表 | 第11-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-20页 |
| ·5′-3′核糖核酸外切酶概述 | 第15页 |
| ·5′-3′核糖核酸外切酶的类型 | 第15-16页 |
| ·5′-3′核糖核酸外切酶1 | 第15-16页 |
| ·5′-3′核糖核酸外切酶2 | 第16页 |
| ·XRN1 的生物学功能 | 第16-17页 |
| ·mRNA 的降解方式 | 第16-17页 |
| ·调节 tRNA 过程 | 第17页 |
| ·XRN1 的应用 | 第17-18页 |
| ·响应面法简介及运用 | 第18-19页 |
| ·响应面法在生物学中的应用 | 第18页 |
| ·响应面法在食品科学中的应用 | 第18-19页 |
| ·响应面法在其他方面的应用 | 第19页 |
| ·小结 | 第19-20页 |
| 第二章 实验内容及技术路线 | 第20-22页 |
| ·实验目的 | 第20页 |
| ·实验的主要内容 | 第20-21页 |
| ·实验技术路线 | 第21-22页 |
| 第三章 Xrn1 基因的生物信息学分析 | 第22-27页 |
| ·生物信息学工具和数据库资源 | 第22-23页 |
| ·方法 | 第23页 |
| ·基因序列的查找与分析 | 第23页 |
| ·蛋白质疏水性分析 | 第23页 |
| ·蛋白质二级结构序列预测 | 第23页 |
| ·系统进化树构建 | 第23页 |
| ·结果 | 第23-26页 |
| ·Xrn1 基因的序列 | 第23-24页 |
| ·疏水性分析 | 第24-25页 |
| ·Xrn1 基因的二级结构分析 | 第25页 |
| ·系统进化树的构建 | 第25-26页 |
| ·讨论 | 第26-27页 |
| 第四章 毕赤酵母表达 XRN1 蛋白 | 第27-43页 |
| ·材料 | 第27-28页 |
| ·质粒与菌株 | 第27页 |
| ·常用生化试剂 | 第27页 |
| ·试剂的配置 | 第27-28页 |
| ·仪器及设备 | 第28页 |
| ·方法 | 第28-39页 |
| ·重组表达质粒 pPIC3.5K-Xrn1 的构建 | 第28-33页 |
| ·引物设计 | 第28-29页 |
| ·目的基因的扩增 | 第29页 |
| ·回收目的片段 | 第29-30页 |
| ·提取质粒 pPIC3.5K | 第30-31页 |
| ·质粒 pPIC3.5K 和 PCR 产物分别进行双酶切 | 第31-32页 |
| ·酶切产物的连接和转化 | 第32页 |
| ·pPIC3.5K-Xrn1 重组子的筛选及鉴定 | 第32-33页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第33-35页 |
| ·毕赤酵母电转化感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·重组载体的线性化 | 第33-34页 |
| ·线状质粒 DNA 的脱磷酸化处理 | 第34页 |
| ·回收线性化质粒 | 第34页 |
| ·进行电转化处理 | 第34-35页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第35页 |
| ·甲醇的诱导表达 | 第35-36页 |
| ·重组酵母的诱导表达 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE 检测蛋白表达 | 第36-38页 |
| ·酵母胞内表达蛋白的检测 | 第36页 |
| ·真核重组蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| ·真核重组蛋白的浓缩 | 第37页 |
| ·重组蛋白的鉴定 | 第37-38页 |
| ·Bradford 法测真核重组蛋白的浓度 | 第38-39页 |
| ·结果与分析 | 第39-42页 |
| ·PCR 扩增完整的 Xrn1 基因 | 第39页 |
| ·质粒表达载体的构建与鉴定 | 第39-40页 |
| ·SDS-PAGE 检测蛋白表达 | 第40-41页 |
| ·Western blotting 进行鉴定 | 第41页 |
| ·重组蛋白的浓度测定 | 第41-42页 |
| ·小结 | 第42-43页 |
| 第五章 响应面法优化基础盐发酵培养基 | 第43-58页 |
| ·材料与方法 | 第43-44页 |
| ·菌株和质粒 | 第43页 |
| ·酶和试剂 | 第43页 |
| ·培养基的配置 | 第43页 |
| ·毕赤酵母工程株的培养 | 第43-44页 |
| ·目的蛋白表达量的检测 | 第44页 |
| ·结果与分析 | 第44-57页 |
| ·单因子实验确定发酵培养基成分的 2 水平大小 | 第44-50页 |
| ·不同浓度酵母提取物对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第44-45页 |
| ·不同浓度硫酸钙对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第45页 |
| ·不同浓度硫酸镁对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第45-46页 |
| ·不同浓度甘油对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第46-47页 |
| ·不同浓度硫酸钾对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第47页 |
| ·不同浓度磷酸对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第47-48页 |
| ·不同浓度硫酸铵对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第48-49页 |
| ·不同浓度氢氧化钾对 XRN1 蛋白表达菌株生物量的影响 | 第49-50页 |
| ·响应面法优化培养基 | 第50-53页 |
| ·Plackett-Burman 法筛选影响发酵培养基的主要因素 | 第50-51页 |
| ·最陡爬坡逼近最大响应面区域 | 第51-52页 |
| ·响应面法分析确定最大响应值 | 第52-53页 |
| ·Box-Behnken Design 实验数据分析 | 第53-57页 |
| ·结论 | 第57-58页 |
| 总结与展望 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 附录一 重要试剂的配置 | 第65-67页 |
