| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-47页 |
| 第一章 猪圆环病毒及其相关疾病 | 第11-30页 |
| 1 病原学 | 第11-19页 |
| ·病毒的形态与分类 | 第11-12页 |
| ·病毒的基因组特征 | 第12-13页 |
| ·病毒的功能性蛋白 | 第13-17页 |
| ·Rep和Rep’ | 第13-15页 |
| ·Cap | 第15-17页 |
| ·其他ORF的编码蛋白 | 第17页 |
| ·病毒的复制与转录 | 第17-19页 |
| ·病毒DNA的复制机制 | 第17-19页 |
| ·病毒RNA的转录 | 第19页 |
| 2 PCVD诊断 | 第19-22页 |
| ·病毒分离 | 第19-20页 |
| ·病毒核酸的检测 | 第20页 |
| ·病毒抗原的检测 | 第20-21页 |
| ·免疫组织化学法(IHC) | 第20-21页 |
| ·抗原捕获ELISA | 第21页 |
| ·病毒抗体的检测 | 第21-22页 |
| ·间接免疫荧光实验(IFA) | 第21页 |
| ·免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA) | 第21页 |
| ·酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第21-22页 |
| 参考文献 | 第22-30页 |
| 第二章 抗体技术的发展与应用 | 第30-47页 |
| 1 抗体技术的发展历程 | 第30页 |
| 2 第二代抗体——鼠单抗 | 第30-34页 |
| ·杂交瘤抗体技术的产生及发展 | 第30-32页 |
| ·鼠单抗的应用 | 第32-34页 |
| 3 第三代抗体——基因工程抗体 | 第34-41页 |
| ·抗体的分子结构 | 第34-35页 |
| ·鼠单抗人源化 | 第35-36页 |
| ·嵌合抗体 | 第35页 |
| ·重构抗体 | 第35-36页 |
| ·表面重塑抗体 | 第36页 |
| ·链替换 | 第36页 |
| ·小分子抗体 | 第36-38页 |
| ·ScFv和dsFv | 第36-37页 |
| ·Fab | 第37页 |
| ·单区抗体 | 第37页 |
| ·双特异抗体 | 第37-38页 |
| ·抗体融合蛋白 | 第38页 |
| ·细胞内抗体 | 第38-39页 |
| ·抗体库技术 | 第39-41页 |
| ·噬菌体抗体库技术 | 第39-40页 |
| ·核糖体展示抗体库技术 | 第40-41页 |
| 4 转基因/转染色体小鼠技术 | 第41页 |
| 5 抗体药物的产业化发展 | 第41-43页 |
| 参考文献 | 第43-47页 |
| 第二部分 研究内容 | 第47-76页 |
| 第一章 猪圆环病毒Rep蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第47-65页 |
| 摘要 | 第47-48页 |
| 1 材料 | 第48页 |
| ·病毒、载体及菌株 | 第48页 |
| ·酶与试剂 | 第48页 |
| ·抗血清与抗体 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-57页 |
| ·引物设计与合成 | 第48-49页 |
| ·ORF1基因的扩增 | 第49-50页 |
| ·PCR模板的制备 | 第49页 |
| ·PCV1-ORF1的扩增 | 第49-50页 |
| ·PCV2-ORF1的扩增 | 第50页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第50页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第50-53页 |
| ·目的基因PCR产物的纯化 | 第50-51页 |
| ·目的基因PCR纯化产物的双酶切与纯化 | 第51页 |
| ·载体制备 | 第51-52页 |
| ·连接反应 | 第52页 |
| ·感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第52页 |
| ·转化 | 第52页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第52-53页 |
| ·重组Rep蛋白在不同原核系统中的表达 | 第53-55页 |
| ·重组质粒转化表达宿主菌 | 第53页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第53页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第53-54页 |
| ·Western-blotting | 第54页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第54-55页 |
| ·可溶性表达探索 | 第55页 |
| ·重组蛋白的纯化与定量 | 第55-57页 |
| ·变性纯化蛋白 | 第55-56页 |
| ·天然纯化蛋白 | 第56页 |
| ·蛋白含量测定 | 第56-57页 |
| ·重组蛋白的免疫学活性鉴定 | 第57页 |
| 3 结果 | 第57-62页 |
| ·ORF1基因的扩增 | 第57-58页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第58页 |
| ·重组Rep蛋白在不同原核系统中的表达 | 第58-61页 |
| ·在pET28a/BL21(DE3)系统中的表达 | 第58-59页 |
| ·在pET32a/BL21(DE3)系统中的表达 | 第59页 |
| ·在pGEX-4T1/BL21(DE3)系统中的表达 | 第59-61页 |
| ·重组Rep蛋白的纯化及其免疫学活性鉴定 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-65页 |
| 第二章 猪圆环病毒Rep蛋白单克隆抗体的制备 | 第65-76页 |
| 摘要 | 第65页 |
| 1 材料 | 第65-66页 |
| ·病毒与细胞 | 第65页 |
| ·实验动物 | 第65页 |
| ·主要试剂 | 第65-66页 |
| ·主要仪器设备 | 第66页 |
| 2 方法 | 第66-71页 |
| ·抗原制备 | 第66页 |
| ·小鼠免疫 | 第66页 |
| ·杂交瘤细胞株的建立 | 第66-69页 |
| ·骨髓瘤细胞的制备 | 第66-67页 |
| ·免疫脾细胞的制备 | 第67页 |
| ·细胞融合 | 第67-68页 |
| ·杂交瘤细胞的选择性培养 | 第68页 |
| ·抗体检测(间接ELISA法) | 第68页 |
| ·杂交瘤细胞的克隆化筛选培养(有限稀释法) | 第68-69页 |
| ·杂交瘤细胞的保存与复苏 | 第69页 |
| ·单克隆抗体的制备 | 第69-70页 |
| ·细胞培养法 | 第69页 |
| ·腹水诱生法 | 第69-70页 |
| ·单克隆抗体的特性分析 | 第70页 |
| ·ELISA效价测定 | 第70页 |
| ·lg类型与亚类鉴定 | 第70页 |
| ·单克隆抗体的抗原结合能力与特异性分析 | 第70-71页 |
| ·间接ELISA法 | 第70页 |
| ·Western-blotting | 第70页 |
| ·间接免疫荧光抗体实验(IFA) | 第70-71页 |
| 3 结果 | 第71-73页 |
| ·小鼠免疫及其血清抗体监测 | 第71页 |
| ·杂交瘤细胞株的建立 | 第71页 |
| ·单克隆抗体的特性 | 第71-73页 |
| ·单克隆抗体的抗原结合能力与特异性 | 第73页 |
| 4 讨论 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-76页 |
| 附录A 常用试剂配方 | 第76-81页 |
| 附录B 缩略词 | 第81-82页 |
| 附录C 硕士研究生期间的科研成果 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83页 |