| 中文摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-12页 |
| 材料与方法 | 第12-46页 |
| 一 材料 | 第12-22页 |
| 1.实验动物 | 第12页 |
| 2.菌株 | 第12页 |
| 3.细胞株 | 第12页 |
| 4.质粒载体 | 第12-17页 |
| 5.工具酶、实验所需试剂、器材 | 第17-18页 |
| 6.抗体 | 第18-19页 |
| 7.主要仪器及设备 | 第19页 |
| 8.扩增基因所使用的引物 | 第19-21页 |
| 9.RSD-9的RNAi序列及测序引物 | 第21页 |
| 10.RSD-9突变体克隆的PCR扩增 | 第21-22页 |
| 二 方法 | 第22-46页 |
| 1.小鼠睾丸曲细精管显微注射针的制作 | 第22-23页 |
| 2.实验动物手术方法和取材方法 | 第23-24页 |
| 3.小鼠睾丸曲细精管显微注射方法 | 第24-25页 |
| 4.GC1 spg细胞移植所需的受体小鼠的制备 | 第25页 |
| 5.生物信息学分析 | 第25页 |
| 6.质粒载体的构建 | 第25-30页 |
| 7.重组蛋白质的原核表达 | 第30-31页 |
| 8.蛋白质浓度测定 | 第31-32页 |
| 9.兔多克隆抗血清的制备 | 第32-33页 |
| 10.酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体滴度 | 第33-34页 |
| 11.细胞的复苏、传代、冻存 | 第34页 |
| 12.脂质体介导的真核细胞转染法 | 第34-35页 |
| 13.磷酸钙介导的真核细胞转染法 | 第35页 |
| 14.稳定表达细胞系的建立 | 第35-36页 |
| 15.免疫组化 | 第36-37页 |
| 16.免疫荧光 | 第37-38页 |
| 17.TRITC-PNA或FITC-PNA对精子顶体的特异性染色 | 第38页 |
| 18.免疫共沉淀 | 第38-40页 |
| 19.RSD-9突变体的构建 | 第40-43页 |
| 20.转铁蛋白内吞实验 | 第43页 |
| 21.ATP/GTP结合及竞争实验 | 第43-44页 |
| 22.Western blot分析 | 第44-45页 |
| 23.小鼠曲细精管内的抗体直接作用 | 第45-46页 |
| 实验结果 | 第46-86页 |
| 第一部分 小鼠体内生精系统重塑模型的建立 | 第46-56页 |
| 一.小鼠睾丸曲细精管显微注射技术平台的建立 | 第46-47页 |
| 二.GC1 spg细胞移植的受体小鼠模型的鉴定 | 第47-48页 |
| 三.供体GC1 spg细胞的制备 | 第48-50页 |
| 1.荧光染料PKH26标记GC1 spg细胞 | 第48页 |
| 2.稳定表达GFP的GC1 spg细胞株的建立 | 第48-50页 |
| 四.精原细胞系GC1 spg移植后在受体小鼠曲细精管内恢复分化能力 | 第50-56页 |
| 1.GC1 spg细胞在受体曲细精管内存活并定位、增殖 | 第50-51页 |
| 2.GC1 spg细胞在受体曲细精管内恢复分化能力 | 第51-54页 |
| 3.体内生精Marker的检测 | 第54-56页 |
| 第二部分 RSD-9基因功能研究 | 第56-86页 |
| 一.RSD-9蛋白的生物信息学分析 | 第56-64页 |
| 1.RSD-9人染色体定位 | 第57页 |
| 2.RSD-9氨基酸性质分析 | 第57-58页 |
| 3.RSD-9亲疏水性分析 | 第58-59页 |
| 4.RSD-9亚细胞定位 | 第59-60页 |
| 5.RSD-9功能分析 | 第60-64页 |
| 二 Northern blot检测RSD-9在不同组织中的表达 | 第64页 |
| 三 RSD-9蛋白在睾丸组织中的定位 | 第64-65页 |
| 四 RSD-9蛋白与rtSH3P13蛋白相互作用的验证 | 第65-71页 |
| 1.GST-pull down实验验证RSD-9与rtSH3P13的相互作用 | 第65-66页 |
| 2.Co-IP实验验证RSD-9与rtSH3P13的相互作用 | 第66-68页 |
| 3.RSD-9与rtSH3P13的共定位研究 | 第68-71页 |
| 五 RSD-9蛋白和突变RSD-9蛋白的ATP、GTP结合实验 | 第71-72页 |
| 六 RSD-9蛋白参与clathrin介导的内吞过程 | 第72-79页 |
| 1.以HeLa细胞为模型,利用激光共聚焦扫描显微镜研究RSD-9蛋白对于内吞的影响 | 第72-73页 |
| 2.以CHO细胞为模型,利用流式细胞分选仪研究RSD-9蛋白对于内吞的影响 | 第73-79页 |
| 七 RSD-9蛋白参与精子顶体的形成 | 第79-86页 |
| 1.针对RSD-9的小鼠同源基因的RNA干扰有效靶点的筛选 | 第80页 |
| 2.稳定表达pRNAT/H1.1-RSD-9RNAi—negative及pRNAT/H1.1-RSD-9RNAi的GC1 spg细胞株的建立 | 第80-83页 |
| 3.体内敲减RSD-9基因后导致精子发生过程的停滞及精子顶体的缺失 | 第83-84页 |
| 4.小鼠睾丸曲细精管注射RSD-9抗体后导致精子顶体的缺失 | 第84-86页 |
| 讨论 | 第86-90页 |
| 一.GC1 spg细胞移植回体内后,能够存活、增殖和分化 | 第86-87页 |
| 二.RSD-9是一个新的生精过程相关基因 | 第87-88页 |
| 三.RSD-9蛋白参与Clathrin介导的内吞过程 | 第88-89页 |
| 四.RSD-9基因影响精子顶体的形成 | 第89-90页 |
| 总结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-95页 |
| 综述 | 第95-107页 |
| 生精细胞和生精细胞移植 | 第95-102页 |
| 1 精子发生的调控机制 | 第96-97页 |
| 2 睾丸的免疫相容性 | 第97-98页 |
| 3 生精细胞移植的历史回顾 | 第98页 |
| 4 关于精原干细胞和精原干细胞移植 | 第98-100页 |
| 5 关于SSC Niche | 第100-101页 |
| 6 生精细胞移植的应用及前景 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-107页 |
| 英、汉名词缩写及对照 | 第107-111页 |
| 致谢 | 第111页 |
