| 目录 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩略词 | 第11-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-64页 |
| 一、禽流感 | 第13-41页 |
| 1.禽流感的病原学基础 | 第14-23页 |
| 2.禽流感病毒的分布与进化 | 第23-28页 |
| 3.H5N1的传播 | 第28-32页 |
| 4.禽流感病毒的诊断 | 第32-36页 |
| 5.高致病性禽流感病毒疫苗研发 | 第36-39页 |
| 6.禽流感病毒治疗药物 | 第39-41页 |
| 二、巴斯德毕赤酵母(PICHIA PASTORIS)表达系统 | 第41-52页 |
| 1.Pichia pastoris表达系统的特点 | 第41-42页 |
| 2.Pichia pastoris的生物学特点 | 第42-43页 |
| 3.菌株与表达载体 | 第43-46页 |
| 4.外源基因与宿主染色体的整合 | 第46-48页 |
| 5.外源蛋白分泌途径 | 第48-49页 |
| 6.外源蛋白的糖基化 | 第49-52页 |
| 三、蛋白质结构预测 | 第52-56页 |
| 1.蛋白质结构预测发展的必要性 | 第52页 |
| 2.蛋白质结构研究的实验方法 | 第52-53页 |
| 3.蛋白质结构研究的预测方法 | 第53-55页 |
| 4.蛋白质结构预测的应用 | 第55-56页 |
| 四、蛋白质晶体学 | 第56-62页 |
| 1.蛋白质晶体学的结晶原因与解析 | 第57-58页 |
| 2.蛋白质结晶过程 | 第58页 |
| 3.蛋白质晶体的培养方法 | 第58-60页 |
| 4.蛋白质结晶的影响因素 | 第60-62页 |
| 五、本研究的目的和意义 | 第62-64页 |
| 第二章 材料与方法 | 第64-90页 |
| 一、材料 | 第64-71页 |
| 1.主要仪器设备 | 第64-65页 |
| 2.菌株、质粒与酶 | 第65-66页 |
| 3.主要试剂 | 第66页 |
| 4.抗生素储备液的配置 | 第66页 |
| 5.培养基的配置 | 第66-68页 |
| 6.DNA操作相关溶液 | 第68-69页 |
| 7.SDS-PAGE电泳相关试剂 | 第69-70页 |
| 8.Western-Blot试剂 | 第70页 |
| 9.ELISA试剂 | 第70页 |
| 10.其它试剂配制 | 第70-71页 |
| 二、方法 | 第71-90页 |
| 1.DNA相关实验方法 | 第71-74页 |
| 2.P.pastoris酵母相关实验 | 第74-76页 |
| 3.重组酵母菌株的诱导表达 | 第76-77页 |
| 4.发酵罐高密度培养 | 第77-78页 |
| 5.蛋白质性质研究方法 | 第78-79页 |
| 6.重组蛋白质的纯化 | 第79-84页 |
| 7.结构模拟 | 第84-87页 |
| 8.蛋白质晶体培养 | 第87-90页 |
| 第三章 结果与分析 | 第90-131页 |
| 一、重组表达载体pPIC9K-HA1的构建与重组HA1蛋白的表达 | 第90-104页 |
| 1.重组表达载体pPIC9K-HA1的构建与转化 | 第90-93页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-HA1的构建 | 第90-92页 |
| ·酵母电转化与转化子的筛选 | 第92-93页 |
| 2.重组HA1蛋白的高效分泌表达研究 | 第93-94页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第93页 |
| ·基因剂量与重组蛋白HA1分泌表达的关系 | 第93-94页 |
| 3.重组HA1蛋白在摇瓶中诱导表达条件的优化 | 第94-100页 |
| ·甲醇诱导浓度对重组菌株生长与分泌表达的影响 | 第94-95页 |
| ·诱导时不同起始pH值对重组菌株的生长与表达的影响 | 第95-96页 |
| ·诱导温度对重组菌株的生长与表达的影响 | 第96-98页 |
| ·诱导时间对重组HA1蛋白分泌表达的影响 | 第98页 |
| ·单点突变对rHA1分泌表达的影响 | 第98-100页 |
| 4.发酵罐高密度发酵分泌表达rHA1 | 第100-103页 |
| ·种子液的制备 | 第100页 |
| ·甘油培养阶段 | 第100页 |
| ·甲醇补料诱导阶段 | 第100页 |
| ·分批补料发酵结果 | 第100-103页 |
| 5.N-端缺失对rHA1分泌表达量的影响 | 第103-104页 |
| 6.小结 | 第104页 |
| 二、重组HA1蛋白的纯化与性质研究 | 第104-110页 |
| 1.重组HA1蛋白的纯化 | 第104-106页 |
| 2.重组HA1蛋白的N-糖基化鉴定 | 第106-107页 |
| 3.MALDI-TOF-MS鉴定重组HA1蛋白 | 第107-108页 |
| 4.分析超离考察重组HA1蛋白在溶液中的状态 | 第108-110页 |
| 5.小结 | 第110页 |
| 三、重组HA1与HA1-48AA的活性检测 | 第110-115页 |
| 1.重组HA1与HA1-48aa的抗原性检测 | 第110-112页 |
| ·93株单抗盘检测rHA1的生物活性 | 第110-111页 |
| ·重组HA1与HA1-48aa抗原性的比较 | 第111-112页 |
| 2.重组HA1与HA1-48aa的免疫原性 | 第112-114页 |
| ·重组HA1和HA1-48aa免疫小鼠血清的血凝抑制实验 | 第112-114页 |
| ·阻断实验检测anti-rHA1和anti-rHA1-48aa小鼠血清生物活性 | 第114页 |
| 3.小结 | 第114-115页 |
| 四、HA1的表位分析 | 第115-126页 |
| 1.HA1上重要抗原位点的表位预测 | 第115-117页 |
| 2.Glu~(112),Lys~(113),Ile~(114)定点突变对rHA1活性的影响 | 第117-119页 |
| 3.Pro~(118),Tyr~(137)定点突变对rHA1生物活性的影响 | 第119-121页 |
| 4.Ash~(165)定点突变对rHA1上13D4活性的影响 | 第121-124页 |
| 5.aa123～aa145 loop区突变后对rHA1活性的影响 | 第124-126页 |
| 6.小结 | 第126页 |
| 五、13D4 FAB与RHA1复合物晶体的培养研究 | 第126-131页 |
| ·D4Fab-rHA1复合物组分的确定 | 第126-128页 |
| ·D4Fab-rHA1复合物晶体的培养 | 第128-130页 |
| 3.小结 | 第130-131页 |
| 第四章 讨论 | 第131-142页 |
| 一、YU22 HA1与表达系统的选择 | 第131-133页 |
| 二、重组HA1蛋白的有效表达与发酵放大研究 | 第133-136页 |
| 1.摇瓶培养条件摸索 | 第133-135页 |
| 2.分批补料高密度发酵条件摸索 | 第135-136页 |
| 三、重组HA1蛋白的纯化与鉴定 | 第136页 |
| 四、RHA1和RHA1-48AA的活性检测 | 第136-138页 |
| 1.rHA1与rHA1-48aa的活性比较 | 第136-137页 |
| 2.rHA1成为疫苗的可能性 | 第137-138页 |
| 五、HA1的表位研究 | 第138-140页 |
| 1.蛋白质结构预测 | 第138页 |
| 2.分子对接的分析 | 第138-139页 |
| 3.实验验证表位位点 | 第139-140页 |
| 六、13D4FAB与RHA1复合物晶体研究 | 第140-142页 |
| 总结 | 第142-144页 |
| 展望 | 第144-145页 |
| 参考文献 | 第145-160页 |
| 致谢 | 第160-161页 |
| 在校期间发表文章 | 第161-162页 |
