| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 1 引言 | 第9-19页 |
| ·禽流感的研究现状 | 第9-14页 |
| ·禽流感的国内外的流行情况 | 第9-10页 |
| ·禽流感病毒的一般特性 | 第10页 |
| ·禽流感病毒的分子生物学特性 | 第10页 |
| ·禽流感病毒的主要蛋白及其功能 | 第10-12页 |
| ·禽流感的免疫与免疫原性相关的病毒蛋白 | 第12-13页 |
| ·禽流感的防制 | 第13页 |
| ·禽流感疫苗的研究进展 | 第13-14页 |
| ·火鸡疱疹病毒及火鸡疱疹病毒载体的研究进展 | 第14-16页 |
| ·火鸡疱疹病毒的一般特征 | 第14-15页 |
| ·火鸡疱疹病毒的致病性和病毒的增殖 | 第15页 |
| ·火鸡疱疹病毒的分子生物学特性 | 第15-16页 |
| ·火鸡疱疹病毒载体的研究进展 | 第16页 |
| ·重组火鸡疱疹病毒构建的方法和原理 | 第16页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第16-17页 |
| ·研究目标 | 第17页 |
| ·技术路线 | 第17-19页 |
| 2 材料 | 第19-23页 |
| ·毒种 | 第19页 |
| ·载体与质粒 | 第19页 |
| ·菌株 | 第19页 |
| ·实验中所用的酶 | 第19页 |
| ·SPF鸡胚 | 第19-20页 |
| ·主要试剂 | 第20-22页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备及转化所用溶液 | 第20页 |
| ·RNA提取所用溶液 | 第20页 |
| ·质粒DNA提取所用溶液 | 第20-21页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所用溶液 | 第21页 |
| ·制备CEF所需的试剂 | 第21-22页 |
| ·主要仪器 | 第22-23页 |
| 3 方法 | 第23-39页 |
| ·PCR引物的设计 | 第23页 |
| ·禽流感病毒HA和NA基因引物的设计 | 第23页 |
| ·火鸡疱疹病毒US_(10)基因引物的设计 | 第23页 |
| ·包含禽流感病毒HA和NA基因及绿色荧光蛋白基因引物的设计 | 第23页 |
| ·禽流感病毒的增殖及浓缩 | 第23-24页 |
| ·禽流感病毒总RNA的提取 | 第24页 |
| ·禽流感病毒HA和NA基因的扩增 | 第24-25页 |
| ·反转录AIV HA-cDNA和AIV NA-cDNA第一条链的合成 | 第24-25页 |
| ·PCR扩增AIV HA和NA基因 | 第25页 |
| ·重组克隆质粒T-HA和T-NA的构建 | 第25-28页 |
| ·PCR扩增HA和NA基因产物的回收与纯化 | 第25-26页 |
| ·连接 | 第26页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第26页 |
| ·转化 | 第26-27页 |
| ·重组克隆质粒的小量制备——SDS碱裂解法 | 第27页 |
| ·酶切鉴定重组克隆质粒 | 第27-28页 |
| ·禽流感病毒HA和NA基因及绿色荧光蛋白表达盒的构建 | 第28-32页 |
| ·酶切T-HA及Tmd-CMV-IRES-EGFP质粒 | 第28页 |
| ·回收目的片段 | 第28页 |
| ·纯度鉴定 | 第28页 |
| ·连接 | 第28-29页 |
| ·转化 | 第29页 |
| ·质粒的提取 | 第29页 |
| ·酶切鉴定阳性克隆 | 第29页 |
| ·酶切T-NA及Tmd-CMV-HA-IRES-EGFP质粒 | 第29-30页 |
| ·回收目的片段并将其连接 | 第30页 |
| ·转化并提取连接好的质粒 | 第30-32页 |
| ·火鸡疱疹病毒转移载体质粒的构建 | 第32-35页 |
| ·HVT基因组的提取及PCR扩增US_(10)~1和US_(10)~(2a) | 第32-33页 |
| ·HVT转移载体质粒的构建 | 第33-35页 |
| ·表达禽流感病毒HA和NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建 | 第35-39页 |
| ·重组转移载体质粒pUS_(10)-CMV-HA-IRES-NA-EGFP的构建 | 第35-37页 |
| ·共转染 | 第37-39页 |
| 4 结果 | 第39-47页 |
| ·禽流感病毒HA和NA基因的RT-PCR结果 | 第39页 |
| ·重组质粒T-HA和T-NA的酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·禽流感病毒的HA和NA基因及绿色荧光蛋白表达盒的构建 | 第40页 |
| ·火鸡疱疹病毒转移载体质粒的构建 | 第40-44页 |
| ·PCR扩增HVT US_(10)~1和US_(10)~2 | 第40-41页 |
| ·PMD18-T-US_(10)~1质粒的鉴定及US_(10)~1插入载体方向的判定 | 第41-42页 |
| ·PMD18-T-US_(10)~(2a)质粒的鉴定及US_(10)~(2a)插入载体方向的判定 | 第42-44页 |
| ·火鸡疱疹病毒转移载体质粒的鉴定 | 第44页 |
| ·表达禽流感病毒HA和NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建 | 第44-45页 |
| ·共转染 | 第45-47页 |
| 5 讨论 | 第47-52页 |
| ·禽流感病毒RNA的提取 | 第47页 |
| ·选择禽流感病毒HA和NA基因作为目的基因 | 第47页 |
| ·关于绿色荧光蛋白基因 | 第47-48页 |
| ·选择火鸡疱疹病毒作为表达载体 | 第48页 |
| ·关于火鸡疱疹病毒的非必需区基因的克隆 | 第48-49页 |
| ·重组病毒转移载体构建的影响因素 | 第49页 |
| ·关于转染 | 第49-50页 |
| ·重组病毒的筛选 | 第50页 |
| ·重组火鸡疱疹病毒疫苗的应用前景及存在的问题 | 第50-52页 |
| 6 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-59页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第59-60页 |
| 作者简历 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 附发表论文 | 第62-67页 |
