| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 引言 | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-22页 |
| ·磷脂酶A_2 | 第10-15页 |
| ·磷脂酶A_2的分类 | 第10-12页 |
| ·sPLA_2的生物学功能 | 第12-13页 |
| ·磷脂酶A_2催化机理及第49位氨基酸的重要性 | 第13-15页 |
| ·PCR定点突变 | 第15-16页 |
| ·包涵体蛋白质复性 | 第16-19页 |
| ·包涵体形成的原因 | 第16页 |
| ·包涵体的分离 | 第16-17页 |
| ·包涵体的溶解 | 第17页 |
| ·包涵体的复性 | 第17-19页 |
| ·蛋白质二级结构的研究方法 | 第19页 |
| ·PLA_2结构与功能关系的研究现状 | 第19-21页 |
| ·本论文的工作 | 第21-22页 |
| 2 Gln49-磷脂酶A_2的生物信息学分析 | 第22-29页 |
| ·引言 | 第22页 |
| ·实验材料 | 第22-23页 |
| ·主要软件 | 第22-23页 |
| ·主要设备 | 第23页 |
| ·实验方法 | 第23-24页 |
| ·蛋白质序列分析 | 第23页 |
| ·Gln49-PLA_2同源蛋白的地理分布分析 | 第23页 |
| ·Gln49-PLA_2的三级结构模拟 | 第23页 |
| ·Gln49-PLA_2的圆二色光谱分析 | 第23-24页 |
| ·结果与讨论 | 第24-28页 |
| ·Gln49-PLA_2的序列分析 | 第24-25页 |
| ·Gln49-PLA_2的进化树分析 | 第25-26页 |
| ·Gln49-PLA_2同源蛋白的地理分布分析 | 第26页 |
| ·Gln49-PLA_2的空间结构分析 | 第26-28页 |
| ·小结 | 第28-29页 |
| 3 Gln49-磷脂酶A_2第49位氨基酸定点突变及重组质粒构建 | 第29-44页 |
| ·引言 | 第29页 |
| ·实验材料 | 第29-30页 |
| ·实验试剂 | 第29-30页 |
| ·实验仪器 | 第30页 |
| ·实验方法 | 第30-38页 |
| ·引物的设计与合成 | 第30-31页 |
| ·Gln49-PLA_2基因的定点突变 | 第31-33页 |
| ·pET-32a(+)载体的PCR扩增 | 第33-34页 |
| ·酶切载体和目的基因 | 第34页 |
| ·酶切反应物的精制 | 第34页 |
| ·载体与目的基因的连接 | 第34-35页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·转化 | 第35页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第35-36页 |
| ·质粒提取 | 第36-37页 |
| ·质粒的酶切检测 | 第37页 |
| ·测序分析 | 第37-38页 |
| ·结果与讨论 | 第38-43页 |
| ·Gln49-PLA_2基因的定点突变 | 第38-39页 |
| ·fQ49D-PLA_2表达质粒的构建 | 第39-43页 |
| ·fQ49K-PLA_2表达质粒的构建 | 第43页 |
| ·小结 | 第43-44页 |
| 4 Gln49-磷脂酶A_2第49位突变体的表达、分离纯化及酶活检测 | 第44-66页 |
| ·引言 | 第44页 |
| ·实验材料 | 第44-45页 |
| ·菌株与质粒 | 第44页 |
| ·实验药品 | 第44-45页 |
| ·实验仪器 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-53页 |
| ·fQ49D-PLA_2在大肠杆菌中的表达 | 第45-46页 |
| ·fQ49D-PLA_2的纯化前处理 | 第46页 |
| ·IMAC法在线包涵体复性与分离 | 第46-48页 |
| ·纯化工艺的优化 | 第48-49页 |
| ·fQ49D-PLA_2融合部分的切除 | 第49页 |
| ·Q49D-PLA_2的分离纯化 | 第49页 |
| ·酶活检测 | 第49-50页 |
| ·考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度 | 第50-51页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达蛋白 | 第51-53页 |
| ·fQ49K-PLA_2的表达、分离纯化及酶活检测 | 第53页 |
| ·结果与讨论 | 第53-64页 |
| ·fQ49D-PLA_2融合蛋白的表达 | 第53-54页 |
| ·IMAC法在线包涵体复性与分离 | 第54-55页 |
| ·IMAC纯化工艺的优化 | 第55-58页 |
| ·fQ49D-PLA_2融合部分的切除 | 第58页 |
| ·酶切后fQ49D-PLA_2的进一步分离纯化 | 第58-60页 |
| ·fQ49K-PLA_2的表达及分离纯化 | 第60-63页 |
| ·Q49D-PLA_2和Q49K-PLA_2的酶活力 | 第63-64页 |
| ·小结 | 第64-66页 |
| 5 主要结论与展望 | 第66-67页 |
| ·主要结论 | 第66页 |
| ·展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 附录Ⅰ 缩略语表 | 第73-74页 |
| 附录Ⅱ pET-32a(+) | 第74-75页 |
| 附录Ⅲ Gln49-PLA_2同一家族的进化树分析 | 第75-76页 |
| 附录Ⅳ-1 fQ49D-PLA_2的测序图 | 第76-77页 |
| 附录Ⅳ-2 fQ49D-PLA_2的测序图 | 第77-78页 |
| 附录Ⅴ fQ49K-PLA_2的测序图 | 第78-79页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
