| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 第一部分 拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因转化草木樨状黄芪、菊苣. | 第15-93页 |
| Ⅰ 文献综述 | 第15-38页 |
| 1.植物耐盐机理的研究进展 | 第15-31页 |
| ·盐胁迫对植物的的伤害机理 | 第15-17页 |
| ·植物对盐胁迫的感应机理 | 第17-23页 |
| ·盐胁迫的信号产生与植物对其感受的机制 | 第17-19页 |
| ·植物感受到盐胁迫后的信号转导研究进展 | 第19-23页 |
| ·SOS家族信号途径 | 第19-21页 |
| ·Ca~(2+)及钙离子依赖的蛋白激酶(CDPKs)参与的植物盐胁迫应答信号途径 | 第21-22页 |
| ·MAPK蛋白激酶级联传导系统与植物盐胁迫应答 | 第22-23页 |
| ·其它参与植物盐胁迫应答的信号传导途径 | 第23页 |
| ·植物对盐胁迫的适应机制 | 第23-31页 |
| ·植物结构上的耐盐机制 | 第24页 |
| ·植物耐盐的生理学机制 | 第24-31页 |
| ·植物通过细胞离子稳态重建抗盐胁迫 | 第24-27页 |
| ·植物通过合成渗透调节剂对抗高盐环境造成的渗透胁迫 | 第27-29页 |
| ·通过离子区隔化作用(Ionic compartmentalization)将盐离子集中到液泡中 | 第29页 |
| ·活性氧清除机制 | 第29-30页 |
| ·富集晚期胚胎蛋白(LEA蛋白)增强植物耐盐性 | 第30-31页 |
| 2.植物Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的研究进展 | 第31-36页 |
| ·植物质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因与Na~+外排 | 第32页 |
| ·植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因 | 第32-35页 |
| ·植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆 | 第33页 |
| ·液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的结构和表达特征 | 第33-35页 |
| ·应用液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的植物转基因研究进展 | 第35-36页 |
| 3.本研究的目的和意义 | 第36-38页 |
| Ⅱ 材料和方法 | 第38-60页 |
| 1 材料 | 第38-40页 |
| ·菌株 | 第38页 |
| ·载体 | 第38页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第38页 |
| ·主要试剂的配制 | 第38-40页 |
| 2 实验方法 | 第40-47页 |
| ·拟南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白全长cDNA ORF克隆引物设计 | 第40页 |
| ·拟南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因全长cDNA ORF的克隆 | 第40-47页 |
| ·盐胁迫下拟南芥总RNA的提取和完整性检测 | 第40-41页 |
| ·拟南芥总RNA反转录即cDNA第一链的合成 | 第41-42页 |
| ·南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因cDNA的获得 | 第42-46页 |
| ·atnhx1 PCR产物与pMD18-T质粒连接的重组质粒鉴定 | 第46-47页 |
| ·atnhx1 RT-PCR产物的序列测定 | 第47页 |
| 3 双元植物表达载体的构建 | 第47-50页 |
| ·atnhx 1基因的植物表达载体pNT-atnhx1的构建 | 第47-48页 |
| ·CaMv35s启动子、TMV RNA 5’UTR Ω序列和Nos polyA终止子的引入 | 第47页 |
| ·atnhx 1基因双元植物表达载体质粒的构建 | 第47-48页 |
| ·植物表达载体质粒导入根癌农杆菌 | 第48-50页 |
| ·农杆菌LBA4404感受态细胞的制备 | 第48页 |
| ·用于农杆菌转化的pNT-atnhx1质粒制备 | 第48-49页 |
| ·农杆菌感受态细胞冻融法转化 | 第49页 |
| ·农杆菌重组质粒DNA的提取 | 第49-50页 |
| ·农杆菌重组质粒DNA的PCR及酶切定 | 第50页 |
| 4.农杆菌介导的atnhx1基因对草木樨状黄芪和菊苣的遗传转化 | 第50-60页 |
| ·植物材料无菌苗的培养 | 第50-51页 |
| ·草木樨状黄芪离体再生体系 | 第51页 |
| ·菊苣离体再生体系的建立 | 第51-52页 |
| ·草木樨状黄芪和菊苣对卡那霉素的耐受性测定 | 第52页 |
| ·农杆菌LBA4404(pNT-atnhx1)对草木樨状黄芪和菊苣的遗传转化 | 第52-53页 |
| ·农杆菌LBA4404(pNT-atnhx1)的保存、培养与转化 | 第52页 |
| ·农杆菌侵染外植体条件优化 | 第52-53页 |
| ·草木樨状黄芪和菊苣转化材料的共培养及筛选 | 第53页 |
| ·假定转基因植株的获得与移栽 | 第53页 |
| ·T0代转基因植物的鉴定 | 第53-59页 |
| ·草木樨状黄芪和菊苣基因组DNA的提取 | 第54页 |
| ·转基因植物的PCR检测 | 第54-55页 |
| ·转基因植物的Southern blot杂交检测 | 第55-58页 |
| ·转基因草木樨状黄芪和菊苣的RT-PCR检测 | 第58-59页 |
| ·转基因植物耐盐性检测 | 第59-60页 |
| ·转基因植物愈伤组织对NaCl的胁迫的抗性分析 | 第59页 |
| ·转基因植物愈伤组织在NaCl胁迫下的游离脯氨酸含量测定 | 第59页 |
| ·转基因植物愈伤组织在NaCl胁迫下的Na~+、K~+含量测定 | 第59页 |
| ·转基因植物在NaCl胁迫下的叶片Na~+、K~+含量测定 | 第59-60页 |
| ·转基因植物在NaCl胁迫下的叶片电导率测定 | 第60页 |
| Ⅲ 结果与分析 | 第60-81页 |
| 1 拟南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析 | 第60-65页 |
| ·盐胁迫下拟南芥总RNA的提取和完整性检测 | 第60页 |
| ·通过PCR获得atnhx1-cDNA | 第60-61页 |
| ·atnhx1基因编码区全长cDNA的序列测定与分析 | 第61-65页 |
| 2.植物表达载体系统的构建 | 第65-68页 |
| ·植物表达载体质粒的构建过程 | 第65-66页 |
| ·双元植物表达载体pNT-atnhx1质粒的鉴定 | 第66-67页 |
| ·双元植物表达载体质粒转化农杆菌LBA4404 | 第67-68页 |
| 3.农杆菌介导的atnhx1基因对草木樨状黄芪和菊苣的遗传转化 | 第68-81页 |
| ·受体植物卡那霉素抗性的确定 | 第68-75页 |
| ·受体植物离体再生体系 | 第68-70页 |
| ·农杆菌转化植物条件优化 | 第70-72页 |
| ·外植体预培养时间对转化效率的影响 | 第70-71页 |
| ·乙酰丁香酮对转化的影响 | 第71-72页 |
| ·农杆菌菌液浓度和侵染时间对转化的影响 | 第72页 |
| ·转基因植物的获得 | 第72-75页 |
| ·转atnhx1基因草木樨状黄芪的获得 | 第72-74页 |
| ·转atnhx1基因菊苣的获得 | 第74-75页 |
| ·转基因植株的分子生物学鉴定 | 第75-77页 |
| ·转基因植物的PCR检测 | 第75页 |
| ·转基因植物的Southern blot杂交检测 | 第75-76页 |
| ·转基因植物的RT-PCR检测 | 第76-77页 |
| ·转基因植物耐盐性的初步生理鉴定 | 第77-81页 |
| ·转基因植物愈伤组织对NaCl的胁迫的耐受性分析结果 | 第77页 |
| ·NaCl胁迫下转基因植物愈伤组织的游离脯氨酸含量测定结果 | 第77-78页 |
| ·转基因株系愈伤组织在NaCl胁迫下的Na+/K+含量测定结果 | 第78-79页 |
| ·转基因植株在NaCl胁迫下的叶片Na+/K+含量测定结果 | 第79-80页 |
| ·转基因植株在NaCl胁迫下的叶片电导率测定结果 | 第80-81页 |
| Ⅳ 讨论 | 第81-85页 |
| 1.农杆菌介导的草木樨状黄芪和菊苣遗传转化体系的建立及其优化 | 第81-83页 |
| ·植物筛选标记基因的选择及筛选剂工作浓度的确定 | 第81-82页 |
| ·农杆菌介导的草木樨状黄芪和菊苣遗传转化体系的优化 | 第82-83页 |
| ·最佳外植体预培养时间、农杆菌菌液浓度和农杆菌侵染时间的确定 | 第82-83页 |
| ·乙酰丁香酮对转化效率的影响 | 第83页 |
| 2.转atnhx1基因草木樨状黄芪和菊苣耐盐性分析 | 第83-85页 |
| ·转atnhx1植物细胞水平耐盐性检测分析 | 第83-84页 |
| ·转atnhx1基因植物K~+,Na~+含量分析 | 第84-85页 |
| ·转atnhx1基因植物游离脯氨酸含量分析 | 第85页 |
| ·转atnhx1基因植物的相对电导率分析 | 第85页 |
| Ⅴ 结论 | 第85-87页 |
| Ⅵ 本研究创新点 | 第87页 |
| Ⅶ 本研究有待进一步开展的工作 | 第87页 |
| 参考文献 | 第87-93页 |
| 第二部分 青稞甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及其转化烟草研究 | 第93-144页 |
| Ⅰ 文献综述 | 第93-99页 |
| 1.甜菜碱的合成及与其相关基因的遗传工程 | 第93-97页 |
| ·甜菜碱的生物学特性和生理功能 | 第93-95页 |
| ·植物甜菜碱的生物合成途径研究进展 | 第95-96页 |
| ·植物甜菜碱的生物合成相关基因的遗传工程研究概况 | 第96-97页 |
| 2.本研究的目的和意义 | 第97-99页 |
| Ⅱ 材料和方法 | 第99-118页 |
| 1 材料与试剂 | 第99-101页 |
| ·植物材料 | 第99页 |
| ·菌株与质粒 | 第99页 |
| ·试剂与试剂盒 | 第99页 |
| ·主要溶液与抗生素配制 | 第99-101页 |
| 2 方法 | 第101-118页 |
| ·青稞甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因中间保守区引物设计 | 第101页 |
| ·青稞甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA中间保守区的克隆 | 第101-104页 |
| ·盐胁迫下青稞总RNA的提取和完整性检测 | 第101-102页 |
| ·青稞总cDNA第一链的合成 | 第102页 |
| ·青稞badh基因中间保守区的获得 | 第102-104页 |
| ·青稞badh基因中间保守区PCR扩增产物的序列测定 | 第104页 |
| ·青稞badh基因3’端的克隆 | 第104-105页 |
| ·总RNA的提取 | 第104页 |
| ·青稞cDNA第一链的合成 | 第104-105页 |
| ·青稞badh基因5’端部分序列的克隆 | 第105-110页 |
| ·总RNA的提取 | 第105页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第105-107页 |
| ·PCR扩增青稞badh基因5’端序列的尝试 | 第107-110页 |
| ·青稞badh基因cDNA编码区的获得 | 第110-112页 |
| ·总RNA的提取和变性处理 | 第110页 |
| ·PrimeScript reverse transcriptase催化的cDNA第一链的合成 | 第110-111页 |
| ·RNase H处理反转录产物、TdT催化的单链cDNA5’端加polyC尾反应 | 第111页 |
| ·PCR法扩增双链cDNA | 第111-112页 |
| ·PCR扩增青稞badh基因编码区序列 | 第112页 |
| ·青稞badh基因编码区序列测定 | 第112页 |
| ·青稞badh基因编码区的原核表达 | 第112-114页 |
| ·青稞badh-cDNA与原核表达载体pMAL-c2X质粒的连接 | 第112-113页 |
| ·青稞badh-cDNA与原核表达载体pMAL c-2-X质粒的连接重组质粒的酶切鉴定 | 第113页 |
| ·大肠杆菌TB1感受态细胞的制备 | 第113页 |
| ·青稞badh-cDNA原核表达SDS-PAGE检测 | 第113-114页 |
| ·青稞badh基因植物表达载体的构建 | 第114-117页 |
| ·CaMV35S启动子的获得 | 第114-115页 |
| ·Nos polyA终止子的获得 | 第115页 |
| ·启动子、终止子、青稞badh-cDNA与pCAMBIA1301的重组 | 第115-116页 |
| ·pCAM-ba转化根癌农杆菌LBA4404 | 第116-117页 |
| ·青稞badh-cDNA对烟草的遗传转化 | 第117-118页 |
| ·烟草再生系统的建立 | 第117页 |
| ·叶圆盘法转化烟草 | 第117-118页 |
| ·转基因植株的初步分子检测 | 第118页 |
| Ⅲ 结果与分析 | 第118-131页 |
| 1.青稞BADH基因中间片段的克隆 | 第118-119页 |
| 2.青稞BADH基因3’端的克隆 | 第119-120页 |
| 3.青稞BADH基因部分5’端片段的分离 | 第120-122页 |
| ·5’RACE法直接克隆青稞badh基因部分5’端序列的尝试 | 第120-122页 |
| ·Inverse PCR 5’RACE法克隆青稞BADH基因部分5’端序列的尝试 | 第120-121页 |
| ·末端加尾5’RACE法直接克隆青稞badh基因部分5’端序列的尝试 | 第121-122页 |
| 4.青稞badh基因cDNA编码区的获得和序列分析 | 第122-127页 |
| 5.青稞badh-cDNA的原核表达 | 第127-128页 |
| 6.青稞badh基因植物表达载体的构建 | 第128-130页 |
| 7.青稞badh基因对烟草的遗传转化及转基因植株的初步鉴定 | 第130-131页 |
| ·转青稞badh基因烟草的PCR检测 | 第130页 |
| ·转基因植株中badh-cDNA基因转录水平上表达的RT-PCR检测 | 第130-131页 |
| Ⅳ 讨论 | 第131-139页 |
| 1.标记探针筛选cDNA文库是获得未知基因的全长cDNA | 第131-133页 |
| 2.RACE法获得未知基因的全长cDNA及RACE技术的改良 | 第133-136页 |
| 3.青稞badh基因cDNA全长编码框的获得 | 第136-138页 |
| 4.其他方法获取全长cDNA的方法 | 第138-139页 |
| ·载体引物法 | 第138页 |
| ·固相支持物法 | 第138页 |
| ·CAP-Finder法 | 第138页 |
| ·CAPture法 | 第138-139页 |
| Ⅴ 结论 | 第139-140页 |
| Ⅵ 本研究创新点 | 第140页 |
| Ⅶ 本研究有待进一步开展的工作 | 第140页 |
| 参考文献 | 第140-144页 |
| 致谢 | 第144页 |
