| 中文摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-19页 |
| 第一篇 文献综述 | 第19-57页 |
| 第1章 荧光定量RT-PCR及其在病毒学中的应用 | 第19-32页 |
| 1 Real-time PCR原理 | 第20-24页 |
| ·染料法 | 第20-21页 |
| ·探针法 | 第21-23页 |
| ·分子信标 | 第23页 |
| ·杂交探针 | 第23-24页 |
| ·蝎形引物(探针) | 第24页 |
| 2 Real-time PCR技术 | 第24-27页 |
| ·扩增片段的选择及设计 | 第24页 |
| ·引物设计 | 第24-25页 |
| ·探针设计 | 第25-26页 |
| ·循环域值 | 第26页 |
| ·标准曲线 | 第26-27页 |
| 3 多重PCR | 第27页 |
| 4 荧光定量real-time RT-PCR在病毒研究中的应用 | 第27-29页 |
| ·病毒病的诊断 | 第28页 |
| ·病毒荷载量测定 | 第28-29页 |
| ·其他 | 第29页 |
| 5 Real-time PCR用于病毒检测的优势 | 第29-30页 |
| ·敏感性高 | 第29页 |
| ·特异性强 | 第29-30页 |
| ·检测速度快 | 第30页 |
| ·检测通量高 | 第30页 |
| 结束语 | 第30-32页 |
| 第2章 RNA干涉及在传染病治疗中的的应用 | 第32-57页 |
| 1 RNAi的发现 | 第33-35页 |
| ·植物的转录后基因沉默 | 第33-34页 |
| ·共抑制和RNA干涉 | 第34页 |
| ·RNAi的基本过程 | 第34-35页 |
| ·哺乳动物的RNAi | 第35页 |
| 2 RNAi重要特征 | 第35-37页 |
| ·siRNA | 第36页 |
| ·RNAi的放大和系统传输 | 第36-37页 |
| 3 RNAi系统的组成 | 第37-42页 |
| ·Dicer酶 | 第37-38页 |
| ·RNA诱导沉默复合体 | 第38-40页 |
| ·RNA依赖的RNA聚合酶 | 第40-41页 |
| ·跨膜蛋白(通道或受体) | 第41-42页 |
| 4 RNAi的机制 | 第42-46页 |
| ·dsRNA被切割成siRNAs | 第42-43页 |
| ·siRNAs的放大 | 第43-44页 |
| ·mRNA的降解 | 第44-46页 |
| 5 RNAi与基因组的完整性和防御有关 | 第46-47页 |
| 6 RNAi在病毒病预防和治疗中的应用 | 第47-55页 |
| ·新型抗病毒疗法 | 第47-49页 |
| ·RNAi在传染病治疗中的应用 | 第49-55页 |
| 7 RNAi防治哺乳动物病毒病存在的问题及前景展 | 第55-57页 |
| ·递送问题 | 第55-56页 |
| ·有效siRNAs的选择 | 第56-57页 |
| 第二篇 研究报告 | 第57-120页 |
| 第3章 引言 | 第57-59页 |
| 第4章 Real-time RT-PCR检测中强毒力鸡新城疫病毒的研究 | 第59-75页 |
| 1 材料 | 第60-61页 |
| ·鸡胚和毒株 | 第60-61页 |
| ·主要试剂 | 第61页 |
| 2 方法 | 第61-64页 |
| ·引物与探针的设计合成 | 第61-62页 |
| ·病毒的培养 | 第62页 |
| ·NDV(m)RNA提取 | 第62页 |
| ·NDV VFP基因克隆标准品制备 | 第62页 |
| ·Real-time PCR | 第62-63页 |
| ·RRT-PCR的灵敏度 | 第63页 |
| ·RRT-PCR的特异性 | 第63页 |
| ·重复性 | 第63页 |
| ·临床病料的RRT-PCR检测 | 第63-64页 |
| ·病毒的鸡胚分离鉴定 | 第64页 |
| ·系统发生分析 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-72页 |
| ·RRT-PCR反应体系的优化 | 第64-66页 |
| ·灵敏度 | 第66-68页 |
| ·特异性试验结果 | 第68-70页 |
| ·重复性 | 第70-71页 |
| ·稳定性 | 第71页 |
| ·临床样本的RRT-PCR检测 | 第71-72页 |
| ·系统发育分析 | 第72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| 5 结论 | 第74-75页 |
| 第5章 相对定量RT-PCR测定NDV NP基因方法的建立 | 第75-87页 |
| 1 材料 | 第76-79页 |
| ·病毒与鸡胚 | 第76-77页 |
| ·NDV的培养 | 第77页 |
| ·总RNA的提取与cDNA合成 | 第77页 |
| ·标准品制备 | 第77-78页 |
| ·SYBR Green IRRT-PCR检测NDV NP基因在CEF中的表达规律 | 第78-79页 |
| 3 结果 | 第79-84页 |
| ·引物的设计 | 第79页 |
| ·PCR扩增产物的鉴定 | 第79-80页 |
| ·优化的SYBR green Ⅰ RRT-PCR条件 | 第80-82页 |
| ·NDV NP基因在鸡胚成纤维细胞上的表达规律 | 第82-83页 |
| ·NDV HA检测结果 | 第83-84页 |
| 4 小结与讨论 | 第84-87页 |
| ·本研究首次成功地建立了SYBR green Ⅰ RRT-PCR定量NDV NP基因的方法 | 第84-85页 |
| ·用建立的SYBR green Ⅰ RRT-PCR方法定量检测了NDV感染鸡胚成纤维细胞后NP基因的表达规律,初步验证了该基因的功能 | 第85-86页 |
| ·建立的SYBR green Ⅰ RRT-PCR定量检测NP基因的方法为进一步利用RNAi研究病毒基因功能研究及基因治疗研究奠定了基础 | 第86-87页 |
| 第6章 在鸡胚成纤维细胞中进行RNAi技术平台的研究 | 第87-104页 |
| 1 材料 | 第89页 |
| ·病毒及载体 | 第89页 |
| ·鸡胚及细胞 | 第89页 |
| ·试剂 | 第89页 |
| ·仪器设备 | 第89页 |
| 2 方法 | 第89-91页 |
| ·细胞培养 | 第89-90页 |
| ·转染试剂对细胞的毒性试验 | 第90页 |
| ·转染试剂的转染效率 | 第90页 |
| ·Ade-GFP对CEF和MDCK的感染性 | 第90-91页 |
| ·GFP-siRNA干涉Ade-GFP介导的GFP基因在CEF和MDCK上的表达 | 第91页 |
| 3 结果 | 第91-101页 |
| ·转染试剂对细胞的毒性 | 第91-93页 |
| ·Silent-fect在CEF和MDCK中转染GFP重组质粒的效率 | 第93-94页 |
| ·Ade-GFP在293细胞中的增殖 | 第94-95页 |
| ·Ade-GFP对CEF及MDCK细胞的感染性 | 第95-99页 |
| ·GFP-siRNA干涉腺病毒介导的GFP基因在CEF及MDCK细胞中的表达 | 第99-101页 |
| 4 讨论 | 第101-103页 |
| 5 结论 | 第103-104页 |
| 第7章 RNA干涉抑制NDV增殖的研究 | 第104-119页 |
| 1 材料 | 第105-106页 |
| ·病毒 | 第105页 |
| ·鸡胚 | 第105页 |
| ·试剂 | 第105页 |
| ·仪器设备 | 第105-106页 |
| 2 方法 | 第106-107页 |
| ·shRNA分子的设计 | 第106页 |
| ·病毒培养及测定 | 第106页 |
| ·鸡胚成纤维细胞(CEF)培养 | 第106页 |
| ·编码shRNA质粒对CEF转染条件的优化 | 第106-107页 |
| ·shRNA在CEF中干涉NDV试验 | 第107页 |
| ·shRNA干涉NDV在鸡胚中的增殖 | 第107页 |
| 3 结果 | 第107-115页 |
| ·NDV NP基因特异的发夹样结构小RNA(shRNA)的设计 | 第107-108页 |
| ·NDV F48E8病毒增殖结果 | 第108-109页 |
| ·优化的HK转染继代CEF条件 | 第109-110页 |
| ·Ndv1在CEF中干涉NDV的效果 | 第110-115页 |
| ·ndv1干涉NDV在鸡胚中的增殖 | 第115页 |
| 4 讨论 | 第115-119页 |
| ·shRNA能有效抑制NDV NP基因在CEF中的表达 | 第115-116页 |
| ·质粒载体能在CEF中高效表达针对NP基因的siRNA | 第116页 |
| ·NP基因与NDV复制有关 | 第116-117页 |
| ·腺病毒载体有望成为有效递送siRNA用于鸡的基因治疗的理想载体 | 第117-119页 |
| 第8章 结论 | 第119-120页 |
| 创新点 | 第120页 |
| 本论文的不足 | 第120-121页 |
| 参考文献 | 第121-138页 |
| 缩略语 | 第138-140页 |
| 附录 | 第140-141页 |
| 致谢 | 第141页 |
