| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-5页 |
| 目录 | 第5-11页 |
| 一.前言 | 第11-19页 |
| ·黄曲霉毒素简介 | 第11-13页 |
| ·黄曲霉毒素的化学结构 | 第11-12页 |
| ·黄曲霉毒素的生物合成 | 第12-13页 |
| ·黄曲霉毒素的危害 | 第13页 |
| ·黄曲霉毒素去毒化的研究进展 | 第13-14页 |
| ·巴斯德毕赤酵母菌表达系统的简介 | 第14-16页 |
| ·毕赤酵母菌 | 第14-15页 |
| ·分泌型表达载体pPICzaA | 第15-16页 |
| ·密码子偏好性与外源蛋白表达 | 第16-17页 |
| ·基因合成技术 | 第17页 |
| ·实验思路和目的 | 第17-19页 |
| 二.实验设备及材料 | 第19-23页 |
| ·主要仪器设备 | 第19页 |
| ·实验材料 | 第19-23页 |
| ·菌种及载体 | 第19页 |
| ·酶类 | 第19-20页 |
| ·试剂盒 | 第20页 |
| ·常用试剂 | 第20页 |
| ·分子量参照物 | 第20页 |
| ·培养基 | 第20-21页 |
| ·试剂与母液配制 | 第21-23页 |
| 三.实验方法 | 第23-48页 |
| ·Armillariella tabescens与Pichia Pastoris密码子偏好性图示及ADTZ’5’末端部分序列Opt-A的密码子优化 | 第23-24页 |
| ·优化后N-Opt-ADTZ序列获得设讨 | 第24-27页 |
| ·Two-step DNA synthesis method原理图 | 第25页 |
| ·Two-step DNA synthesis method引物的设计 | 第25-27页 |
| ·Two-step DNA synthesis method合成优化片段Opt-A’实验步骤 | 第27-39页 |
| Ⅰ.One-Step | 第27-36页 |
| ·1~(st) PCR扩增DNA片段 | 第27-29页 |
| ·2~(rd) PCR扩增DNA片段 | 第29-31页 |
| ·PCR产物切胶回收 | 第31-32页 |
| ·TA克隆 | 第32-34页 |
| ·测序 | 第34-35页 |
| ·亚克隆DNA片段Opt-A1,Opt-A2,Opt-A3,Opt-A4以及P3。 | 第35-36页 |
| Ⅱ.Two-step | 第36-39页 |
| ·PCR拼接DNA片段Opt-A’ | 第36-38页 |
| ·切胶回收PCR产物 | 第38页 |
| ·TA克隆 | 第38页 |
| ·测序 | 第38-39页 |
| ·回复突变实验 | 第39-41页 |
| ·回复突变引物设计 | 第39页 |
| ·实验流程 | 第39-41页 |
| ·切胶回收PCR产物 | 第41页 |
| ·PCR扩增密码子未优化DNA片段ADTZ-B | 第41-42页 |
| ·引物设计 | 第41页 |
| ·PCR扩增 | 第41-42页 |
| ·切胶回收PCR产物 | 第42页 |
| ·Gene SOEing法拼接优化后的完整阅读框序列N-Opt-ADTZ | 第42-45页 |
| ·Gene SOEing图示 | 第42页 |
| ·引物设计 | 第42-43页 |
| ·The 1~(st) PCR扩增DNA片段N-Opt-ADTZ | 第43页 |
| ·The 2~(rd) PCR扩增DNA片段N-Opt-ADTZ | 第43-44页 |
| ·切胶回收2~(rd)PCR产物 | 第44-45页 |
| ·重组质粒pPICzaA_N-Opt-ADTZ(以下简称pNOA)的构建 | 第45-48页 |
| ·pPICzaA质粒图谱 | 第45页 |
| ·EcoR I和Not I双酶切DNA片段N-Opt-ADTZ,载体pPICzaA | 第45-46页 |
| ·质粒pPICzaA和目的基因N-Opt-ADTZ的连接 | 第46页 |
| ·CaCl_2法制备E.coli Top10F’感受态细胞,操作参照3.3.4.3 | 第46页 |
| ·转化Top10F’感受态细胞 | 第46页 |
| ·碱提质粒 | 第46-47页 |
| ·酶切鉴定重组质粒pNOA | 第47页 |
| ·测序 | 第47-48页 |
| 四.实验结果 | 第48-68页 |
| ·优化后N-Opt-ADTZ理论序列 | 第48-49页 |
| ·核酸序列 | 第48-49页 |
| ·蛋白序列 | 第49页 |
| ·Two-step DNA synthesis产物结果 | 第49-60页 |
| ·one-step PCR产物电泳检测 | 第49-51页 |
| ·DNA片段P3,Opt-A1,2,3,4与pMD_19T构建重组质粒酶切鉴定图 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增DNA片段P3,Opt-A1,2,3,4的测序结果 | 第52-58页 |
| ·DNA片段P3,Opt-A1,2,3,4亚克隆PCR电泳检测 | 第58-59页 |
| ·two-step PCR产物电泳检测 | 第59-60页 |
| ·DNA片段Opt-A’与pMD_19T构建重组质粒酶切鉴定图 | 第60-61页 |
| ·DNA片段Opt-A’序列结果 | 第61-62页 |
| ·DNA片段Opt-A’测序结果 | 第61页 |
| ·DNA片段Opt-A’测序结果去除载体序列 | 第61-62页 |
| ·PCR扩增ADTZ-B结果电泳检测 | 第62-63页 |
| ·回复突变PCR扩增DNA片段Opt-A’1和Opt-A’2结果电泳检测 | 第63页 |
| ·Gene SOEing PCR扩增N-Opt-ADTZ结果电泳检测 | 第63-64页 |
| ·重组质粒pNOA酶切鉴定图 | 第64-65页 |
| ·DNA片段N-Opt-ADTZ测序结果 | 第65-68页 |
| ·DNA片段N-Opt-ADTZ测序结果 | 第65-66页 |
| ·DNA片段N-Opt-ADTZ测序结果去除载体序列 | 第66-68页 |
| 五.讨论 | 第68-72页 |
| ·ADTZ密码子优化中的问题 | 第68页 |
| ·密码子改造方法的选择 | 第68页 |
| ·Two-step DNA synthesis method引物设计 | 第68-69页 |
| ·Two-step DNA synthesis过程中的问题 | 第69-70页 |
| ·回复突变的使用 | 第70-72页 |
| 六.结论与展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 附录Ⅰ | 第78-86页 |
