| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1、文献综述 | 第12-23页 |
| ·木聚糖酶的分类 | 第12页 |
| ·木聚糖酶的特性 | 第12-13页 |
| ·木聚糖酶的诱导性 | 第12-13页 |
| ·木聚糖酶的耐热性 | 第13页 |
| ·木聚糖酶的耐酸碱性 | 第13页 |
| ·耐热木聚糖酶 | 第13-22页 |
| ·耐热木聚糖酶的来源 | 第13-14页 |
| ·耐热木聚糖酶的结构域 | 第14页 |
| ·耐热木聚糖酶的耐热分子机理 | 第14-16页 |
| ·热稳定区（Thermostabilizing domain，TSD） | 第15页 |
| ·盐桥（Salt bridge） | 第15页 |
| ·二硫键（Disulfide brige） | 第15页 |
| ·各种氨基酸的含量 | 第15-16页 |
| ·耐热木聚糖酶的生产 | 第16-17页 |
| ·菌种 | 第16页 |
| ·耐热木聚糖酶的基因工程研究 | 第16-17页 |
| ·耐热木聚糖酶的体外分子进化 | 第17-21页 |
| ·易错PCR（Error-prone PCR） | 第18页 |
| ·DNA shuffling | 第18页 |
| ·Family shuffling | 第18-19页 |
| ·交错延伸重组(STEP: Stagger extension process) | 第19页 |
| ·随机引物体外重组(RPR ：Random-priming in vitro recombination) | 第19页 |
| ·临时模板随机嵌合生长( Random chimeragenesis on transient) | 第19页 |
| ·酶分子定向进化的筛选策略 | 第19-20页 |
| ·酶分子定向进化技术的应用 | 第20-21页 |
| ·耐热木聚糖酶的应用 | 第21-22页 |
| ·造纸工业 | 第21页 |
| ·食品工业 | 第21页 |
| ·饲料加工 | 第21页 |
| ·环境保护 | 第21-22页 |
| ·本研究的目的意义 | 第22-23页 |
| 2、木聚糖酶基因的克隆及生物信息学分析 | 第23-50页 |
| ·材料 | 第23-26页 |
| ·菌株与质粒 | 第23-24页 |
| ·试剂与仪器 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25-26页 |
| ·实验方法 | 第26-34页 |
| ·木聚糖酶DNA 的原核表达 | 第26-29页 |
| ·基因组DNA 提取 | 第26页 |
| ·PCR 扩增木聚糖酶基因 | 第26-27页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第27页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第27页 |
| ·重组质粒的筛选、检测 | 第27-28页 |
| ·蛋白质的诱导生成 | 第28页 |
| ·重组蛋白Xyn-1 的纯化 | 第28页 |
| ·SDS-PAGE 及酶活测定 | 第28-29页 |
| ·木聚糖酶DNA 的真核表达 | 第29-31页 |
| ·PCR 扩增木聚糖酶基因 | 第29页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第29页 |
| ·大肠杆菌的转化，重组质粒的筛选、检测 | 第29-30页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·重组质粒pPIC9K-xynD 的转化及筛选 | 第30页 |
| ·酵母基因组的提取 | 第30-31页 |
| ·重组木聚糖酶Xyn-2 的诱导及酶活测定 | 第31页 |
| ·木聚糖酶内含子的确定 | 第31-33页 |
| ·总RNA 的提取 | 第31-32页 |
| ·DNaseI 处理去除黑曲霉A. niger C3486 基因组DNA | 第32页 |
| ·第一链cDNA 反转录合成 | 第32-33页 |
| ·PCR 扩增木聚糖酶基因 | 第33页 |
| ·真核表达载体构建、转化和重组蛋白Xyn-3 的纯化及酶活测定 | 第33页 |
| ·木聚糖酶的生物信息学分析 | 第33-34页 |
| ·实验结果与分析 | 第34-47页 |
| ·黑曲霉A.niger C3486 基因组的分离 | 第34页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第34-38页 |
| ·PCR 扩增及克隆 | 第35-37页 |
| ·融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 | 第37页 |
| ·Xyn-1 的酶活测定 | 第37-38页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第38-41页 |
| ·PCR 扩增及克隆 | 第38-40页 |
| ·阳性酵母转化子的验证及Xyn-2 的酶活测定 | 第40-41页 |
| ·木聚糖酶内含子的确定 | 第41-44页 |
| ·黑曲霉总RNA 的提取 | 第41页 |
| ·表达载体pET28a-xynC 的构建 | 第41-42页 |
| ·PCR 扩增及克隆 | 第42-43页 |
| ·Xyn-3 的酶活测定 | 第43页 |
| ·XynD 与XynC 的测序结果的比对与分析 | 第43-44页 |
| ·木聚糖酶的生物信息学分析 | 第44-47页 |
| ·讨论 | 第47-50页 |
| ·融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 | 第47页 |
| ·融合蛋白Xyn-1 的酶活测定 | 第47-48页 |
| ·木聚糖酶的真核表达 | 第48-49页 |
| ·XynD 与XynC 的序列差异 | 第49-50页 |
| 3、木聚糖酶基因的体外分子进化 | 第50-74页 |
| ·材料 | 第50-51页 |
| ·菌株与质粒 | 第50页 |
| ·培养基及试剂 | 第50-51页 |
| ·实验方法 | 第51-57页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第51-52页 |
| ·以Error prone PCR 获得突变基因文库 | 第52页 |
| ·DNA shuffling | 第52-54页 |
| ·亲本基因的片段化 | 第52-53页 |
| ·片段组装（无外加引物） | 第53页 |
| ·全长基因的扩增（有外加引物） | 第53-54页 |
| ·超级感受态细胞的制备 | 第54页 |
| ·突变文库的构建和筛选 | 第54页 |
| ·木聚糖酶及其突变体的蛋白诱导及检测 | 第54-55页 |
| ·木聚糖酶耐热突变体的耐热性研究 | 第55页 |
| ·木糖标准曲线 | 第55-56页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第56页 |
| ·木聚糖酶的酶活性及酶动力学常数测定 | 第56-57页 |
| ·实验结果与分析 | 第57-70页 |
| ·突变载体的构建 | 第57-58页 |
| ·目的片段的PCR 扩增 | 第58-59页 |
| ·Error prone PCR 获得突变基因文库 | 第59-60页 |
| ·DNA shuffling | 第60-62页 |
| ·突变文库的构建和筛选 | 第62-63页 |
| ·木聚糖酶耐热突变体的诱导表达 | 第63页 |
| ·木聚糖酶耐热突变体的酶活测定 | 第63-64页 |
| ·木聚糖酶耐热突变体的耐热性研究 | 第64-66页 |
| ·木糖标准曲线的制作 | 第66页 |
| ·蛋白标准曲线的制作 | 第66页 |
| ·木聚糖酶XynT 及其耐热突变体的酶活性及K_m、K_(cat)、V_(max) 的比较 | 第66-70页 |
| ·讨论 | 第70-74页 |
| ·木聚糖酶的体外分子进化 | 第70-71页 |
| ·木聚糖酶突变体酶的筛选 | 第71-72页 |
| ·木聚糖酶XynT、XynA 及其突体的酶活性及相关参数的比较 | 第72-73页 |
| ·木聚糖酶突变体XynJ2 | 第73-74页 |
| 4、总结与展望 | 第74-76页 |
| ·结论 | 第74页 |
| ·展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-80页 |
| 附录:溶液及试剂 | 第80-82页 |
| 致谢 | 第82页 |
