| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第8-19页 |
| 1.1 丁二酸的理化性质 | 第8页 |
| 1.2 丁二酸的功能用途与市场分析 | 第8-10页 |
| 1.3 丁二酸的生产方法 | 第10-11页 |
| 1.3.1 化学法合成丁二酸 | 第10页 |
| 1.3.2 酶法转化合成丁二酸 | 第10页 |
| 1.3.3 微生物发酵法合成丁二酸 | 第10-11页 |
| 1.4 发酵法生产丁二酸的研究现状及国内外最新进展 | 第11-16页 |
| 1.4.1 产琥珀酸厌氧螺菌的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.4.2 产琥珀酸放线杆菌的研究进展 | 第13页 |
| 1.4.3 大肠杆菌生产丁二酸的研究进展 | 第13-16页 |
| 1.5 丁二酸合成途径的设计和优化常用策略 | 第16-17页 |
| 1.5.1 敲除竞争途径 | 第16页 |
| 1.5.2 激活PEP羧化激酶,提高能量供给 | 第16页 |
| 1.5.3 改造磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶(PTS)系统 | 第16页 |
| 1.5.4 解除NADH对TCA还原臂的限制 | 第16-17页 |
| 1.5.5 调节丁二酸转运 | 第17页 |
| 1.6 代谢工程与基因敲除技术 | 第17-18页 |
| 1.7 本论文的研究意义与研究内容 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-32页 |
| 2.1 材料 | 第19-22页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第19页 |
| 2.1.2 分子操作中酶和试剂 | 第19-21页 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 | 第21页 |
| 2.1.4 质粒与染色体提取试剂 | 第21页 |
| 2.1.5 培养基 | 第21-22页 |
| 2.2 方法 | 第22-32页 |
| 2.2.1 大肠杆菌基因组DNA的提取 | 第22页 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第22-23页 |
| 2.2.3 DNA片段的纯化回收 | 第23页 |
| 2.2.4 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化 | 第23-24页 |
| 2.2.5 目标基因的整合 | 第24-25页 |
| 2.2.6 引物 | 第25页 |
| 2.2.7 基因片段的扩增 | 第25-27页 |
| 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
| 2.2.9 载体构建 | 第27-29页 |
| 2.2.10 摇瓶发酵 | 第29-30页 |
| 2.2.11 生物量测定 | 第30页 |
| 2.2.12 葡萄糖浓度的测定 | 第30页 |
| 2.2.13 发酵样品分析 | 第30页 |
| 2.2.14 细胞破碎 | 第30页 |
| 2.2.15 蛋白浓度测定 | 第30页 |
| 2.2.16 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力检测 | 第30-32页 |
| 3 结果与讨论 | 第32-48页 |
| 3.1 ppc基因启动子元件的替换 | 第32-36页 |
| 3.1.1 T-argE-ppc载体的构建 | 第32-33页 |
| 3.1.2 kan-cI~(ts)857-P_R-P_L的获得 | 第33-34页 |
| 3.1.3 整合载体T-Pppc::kan-cIts857-PR-PL的构建 | 第34-35页 |
| 3.1.4 运用Red重组系统对ppc启动子进行替换 | 第35-36页 |
| 3.2 温控开关功能的实现 | 第36-40页 |
| 3.2.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)表达水平分析 | 第37-38页 |
| 3.2.2 E.coli B0013-026生理特性 | 第38-39页 |
| 3.2.3 E.coli B0013-026产酸特性 | 第39-40页 |
| 3.3 丁二酸合成新工艺的建立与优化 | 第40-42页 |
| 3.3.1 最适生长温度的确定 | 第40-41页 |
| 3.3.2 最适诱导温度的确定 | 第41-42页 |
| 3.4 B0013-026摇瓶发酵性能及碳源的选择 | 第42-43页 |
| 3.5 甘油为碳源摇瓶发酵合成丁二酸 | 第43-46页 |
| 3.5.1 不同供氧条件下丁二酸的发酵水平 | 第43-45页 |
| 3.5.2 底物浓度对丁二酸的 | 第45-46页 |
| 3.6 蛋白胨的添加对重组菌 E. coli B0013-026发酵的影响 | 第46-47页 |
| 3.6.1 蛋白胨浓度的选择 | 第46页 |
| 3.6.2 在蛋白胨M9培养基中重组菌 E. coli B0013-026的发酵性能 | 第46-47页 |
| 3.7 重组菌E.coli B0013-026在3L发酵罐中的发酵性能 | 第47-48页 |
| 4 结论 | 第48-49页 |
| 5 展望 | 第49-50页 |
| 6 参考文献 | 第50-57页 |
| 7 攻读硕士学位期间的发表论文情况 | 第57-58页 |
| 8 致谢 | 第58页 |
