| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 PD-L1/PD-1免疫检测点信号通路抑制剂的筛选及机制研究 | 第11-92页 |
| 1.1 引言 | 第11-27页 |
| 1.1.1 肿瘤与免疫的关系 | 第12-16页 |
| 1.1.1.1 肿瘤抗原 | 第13-14页 |
| 1.1.1.2 肿瘤免疫逃逸 | 第14-16页 |
| 1.1.2 肿瘤免疫治疗分类 | 第16-18页 |
| 1.1.2.1 肿瘤疫苗 | 第16-17页 |
| 1.1.2.2 嵌合抗原受体T细胞疗法 | 第17页 |
| 1.1.2.3 免疫检测点抑制剂 | 第17-18页 |
| 1.1.3 PD-1、PD-L1和PD-L1/PD-1通路 | 第18-21页 |
| 1.1.3.1 PD-L1/PD-1通路 | 第18-20页 |
| 1.1.3.2 PD-1通路抑制T细胞的效应功能 | 第20-21页 |
| 1.1.3.3 肿瘤细胞中PD-1通路的功能 | 第21页 |
| 1.1.4 已上市的PD-L1/PD-1通路抑制剂 | 第21-23页 |
| 1.1.5 靶向PD-L1/PD-1通路的小分子抑制剂的开发 | 第23-27页 |
| 1.2 实验材料与方法 | 第27-39页 |
| 1.2.1 细胞株及试剂 | 第27-30页 |
| 1.2.1.1 细胞株及培养条件 | 第27页 |
| 1.2.1.2 试剂 | 第27-29页 |
| 1.2.1.3 SiRNA和Primer序列 | 第29-30页 |
| 1.2.2 实验方法 | 第30-39页 |
| 1.2.2.1 质粒转染 | 第30-31页 |
| 1.2.2.2 Western blot检测蛋白表达 | 第31-32页 |
| 1.2.2.3 稳转株单克隆筛选 | 第32-33页 |
| 1.2.2.4 免疫荧光检测蛋白定位 | 第33页 |
| 1.2.2.5 流式细胞仪检测Jurkat细胞表面PD-1表达 | 第33-34页 |
| 1.2.2.6 共培养系统筛选PD-L1抑制剂 | 第34页 |
| 1.2.2.7 MTT法检测细胞存活率 | 第34-35页 |
| 1.2.2.8 PNGase F或Endo H酶消化蛋白的N-糖链 | 第35页 |
| 1.2.2.9 免疫沉淀 | 第35-36页 |
| 1.2.2.10 ER-tracker或Lysosome-tracker red染色 | 第36页 |
| 1.2.2.11 荧光素酶报告基因检测NFAT通路 | 第36页 |
| 1.2.2.12 流式细胞仪检测细胞周期 | 第36-37页 |
| 1.2.2.13 Real-time PCR检测细胞因子转录 | 第37页 |
| 1.2.2.14动物实验 | 第37-39页 |
| 1.3 实验结果 | 第39-86页 |
| 1.3.1 构建稳定表达PD-1和PD-L1分子的单克隆细胞株 | 第39-41页 |
| 1.3.2 检测PD-L1/PD-1相互作用的共培养体系的建立 | 第41-48页 |
| 1.3.2.1 细胞间接触促进共培养后PD-1经溶酶体降解 | 第41-46页 |
| 1.3.2.2 共培养体系的PD-1水平与PD-L1/PD-1相互作用呈负相关 | 第46-47页 |
| 1.3.2.3 PC-9/PD-L1-Jurkat/PD-1共培养体系可用于PD-L1/PD-1抑制剂的筛选 | 第47-48页 |
| 1.3.3 共培养体系筛选阻断PD-L1/PD-1检测点的候选小分子化合物 | 第48-56页 |
| 1.3.3.1 先导化合物的发现 | 第48-54页 |
| 1.3.3.2 阳性化合物阻断PD-L1/PD-1结合的方式与抗体不同 | 第54-56页 |
| 1.3.4 PD-L1是阳性化合物的直接作用靶点 | 第56-57页 |
| 1.3.5 007特异性抑制PD-L1蛋白的N-糖基化 | 第57-67页 |
| 1.3.5.1 007不完全抑制PD-L1糖基化 | 第58页 |
| 1.3.5.2 007特异性抑制PD-L1的糖基化 | 第58-60页 |
| 1.3.5.3 007同时抑制组成型和诱导型PD-L1的糖基化 | 第60-61页 |
| 1.3.5.4 007作用的N-糖基化位点研究 | 第61-67页 |
| 1.3.6 007抑制PD-L1蛋白的膜定位 | 第67-70页 |
| 1.3.7 007诱使PD-L1滞留于内质网中 | 第70-73页 |
| 1.3.8 007促进PD-L1通过蛋白酶体通路降解 | 第73-76页 |
| 1.3.9 007可解除PD-L1/PD-1通路引起的T细胞内部NFAT通路的抑制 | 第76-77页 |
| 1.3.10 007可恢复T细胞效应功能 | 第77-79页 |
| 1.3.11 007应用于动物实验模型 | 第79-86页 |
| 1.3.11.1 007类似物014可在体内抑制人源PD-L1糖基化 | 第79-80页 |
| 1.3.11.2 007系列化合物不作用于鼠源PD-L1 | 第80-86页 |
| 1.4 结果讨论 | 第86-92页 |
| 第2章 Axl抑制剂R428抗肿瘤机理研究 | 第92-143页 |
| 2.1 引言 | 第92-103页 |
| 2.1.1 Axl受体酪氨酸激酶及其抑制剂 | 第92-95页 |
| 2.1.2 细胞死亡概述 | 第95-103页 |
| 2.1.2.1 细胞凋亡 | 第96-97页 |
| 2.1.2.2 自噬与自噬性细胞死亡 | 第97-101页 |
| 2.1.2.3 副凋亡 | 第101-103页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第103-107页 |
| 2.2.1 细胞株及试剂 | 第103-105页 |
| 2.2.1.1 细胞株及培养条件 | 第103页 |
| 2.2.1.2 试剂 | 第103-104页 |
| 2.2.1.3 Primer序列 | 第104-105页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第105-107页 |
| 2.2.2.1 克隆形成实验(结晶紫实验) | 第105页 |
| 2.2.2.2 RTCA实时监测细胞生长曲线实验 | 第105页 |
| 2.2.2.3 活细胞工作站实时检测细胞形态变化实验 | 第105页 |
| 2.2.2.4 中性红或吖啶橙染色实验 | 第105页 |
| 2.2.2.5 细胞骨架染色实验 | 第105-106页 |
| 2.2.2.6 透射电子显微镜分析 | 第106页 |
| 2.2.2.7 生长因子刺激受体内吞降解实验 | 第106-107页 |
| 2.3 实验结果 | 第107-139页 |
| 2.3.1 Axl抑制剂R428发挥抗肿瘤作用不依赖于Axl | 第107-111页 |
| 2.3.2 R428诱导形成异常的泡状结构但不具备paraptosis特征 | 第111-117页 |
| 2.3.3 R428诱导的vacuoles来源于溶酶体 | 第117-121页 |
| 2.3.4 R428影响溶酶体pH值 | 第121-122页 |
| 2.3.5 R428诱导溶酶体和自噬体增多并促进自噬相关基因的表达 | 第122-124页 |
| 2.3.6 R428抑制自噬性降解 | 第124-126页 |
| 2.3.7 R428诱导vacuolization与细胞内部自噬活动程度相关 | 第126-127页 |
| 2.3.8 抑制自噬启始可削弱R428诱导的vacuolization | 第127-130页 |
| 2.3.9 抑制自噬启始可减少R428对细胞生长的抑制 | 第130-132页 |
| 2.3.10 自噬参与R428作用后引起的Axl磷酸化增加 | 第132-134页 |
| 2.3.11 R428同时抑制细胞的内吞途径 | 第134-135页 |
| 2.3.12 有机胺结构赋予R428溶酶体趋向性 | 第135-139页 |
| 2.4 结果讨论 | 第139-143页 |
| 参考文献 | 第143-157页 |
| 附录 | 第157-159页 |
| 致谢 | 第159-162页 |
| 作者简历 | 第162页 |
