| 致谢 | 第4-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-13页 |
| 1.1 烟碱生物合成途径 | 第9-11页 |
| 1.2 bHLH转录因子家族的结构特点 | 第11-12页 |
| 1.3 MYCs(Myelocytomatosis proteins)研究概况 | 第12-13页 |
| 2 引言 | 第13-14页 |
| 3 实验材料 | 第14-16页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第14-16页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第14页 |
| 3.1.2 菌株、载体及试剂 | 第14页 |
| 3.1.3 溶液配制 | 第14-16页 |
| 3.2 主要仪器 | 第16页 |
| 4 实验方法 | 第16-36页 |
| 4.1 转基因烟草烟碱含量的测量 | 第16-21页 |
| 4.1.1 烟草基因组DNA提取(CTAB法) | 第16-17页 |
| 4.1.2 烟草总RNA的提取 | 第17页 |
| 4.1.3 烟草单链cDNA合成 | 第17-18页 |
| 4.1.4 转基因烟株的鉴定 | 第18-19页 |
| 4.1.5 转基因烟株中NtMYC1a/1b基因的表达量分析 | 第19-20页 |
| 4.1.6 气相色谱定量分析转基因烟株中生物碱的含量 | 第20-21页 |
| 4.2 PMT启动子分析 | 第21-22页 |
| 4.2.1 生物信息学分析方法 | 第21页 |
| 4.2.2 非生物胁迫处理 | 第21-22页 |
| 4.2.3 4 个PMT启动子对非生物胁迫处理的响应分析 | 第22页 |
| 4.3 农杆菌瞬时表达 | 第22-24页 |
| 4.3.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| 4.3.2 农杆菌的瞬时表达过程 | 第23页 |
| 4.3.3 转基因烟株GUS表达量分析 | 第23-24页 |
| 4.4 凝胶迁移滞留实验(EMSA) | 第24-32页 |
| 4.4.1 原核表达载体PET-32a-MYC1a/1b的构建 | 第24-26页 |
| 4.4.2 融合蛋白pET-32a-MYC1a/1b的表达 | 第26-28页 |
| 4.4.3 原核表达融合蛋白pET-32a-MYC1a/1b的纯化 | 第28-29页 |
| 4.4.4 EMSA验证MYC1a/1b转录因子与G-box作用元件的是否结合 | 第29-32页 |
| 4.5 酵母单杂交 | 第32-35页 |
| 4.5.1 诱饵载体的构建 | 第32-34页 |
| 4.5.2 猎物载体pGADT7-Prey构建 | 第34页 |
| 4.5.3 诱饵酵母菌株构建 | 第34-35页 |
| 4.5.4 猎物载体-与诱饵基因共转化酵母Y1HGold菌株 | 第35页 |
| 4.6 不同胁迫处理下MYC1a/1b和MYC2a/2b的表达量分析 | 第35-36页 |
| 5 实验结果 | 第36-59页 |
| 5.1 转基因株系鉴定 | 第36-38页 |
| 5.1.1 NtMYC1a/1b过表达烟株的鉴定 | 第36页 |
| 5.1.2 NtMYC1a/1b沉默烟株的鉴定 | 第36-38页 |
| 5.2 转基因株系qPCR鉴定 | 第38-39页 |
| 5.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量 | 第38页 |
| 5.2.2 转基因烟株qPCR分析MYC1a/1b基因的表达量 | 第38-39页 |
| 5.3 气相色谱定量分析转基因烟株中生物碱的含量 | 第39-40页 |
| 5.4 PMT启动子序列生物信息学分析与PMT表达分析 | 第40-43页 |
| 5.5 GUS表达分析MYC1a/1b转录因子与PMT启动子的相互作用 | 第43-46页 |
| 5.5.1 构建重组表达载体pCAMBIA1391-PMT1/PMT2启动子 | 第43-45页 |
| 5.5.2 瞬时表达结果分析 | 第45页 |
| 5.5.3 稳定表达结果分析 | 第45-46页 |
| 5.6 凝胶迁移滞留实验(EMSA)结果分析 | 第46-50页 |
| 5.6.1 原核表达载体PET32a-MYC1a/1b的构建 | 第46-47页 |
| 5.6.2 融合蛋白pET32a-MYC1a/1b的表达 | 第47-49页 |
| 5.6.3 EMSA分析MYC1a/1b转录因子与G-box作用元件的结合反应 | 第49-50页 |
| 5.7 酵母单杂交验证MYC1a/1b转录因子与PMT启动子的相互识别 | 第50-56页 |
| 5.7.1 诱饵载体构建 | 第50-51页 |
| 5.7.2 猎物载体pGADT7-Prey构建 | 第51页 |
| 5.7.3 诱饵酵母菌株构建及自激活验证 | 第51-53页 |
| 5.7.4 酵母单杂验证MYC1a/1b转录因子与PMT的启动子的相互作用 | 第53-56页 |
| 5.8 NtMYC1a/1b与NtMYC2a/2b基因表达分析 | 第56-59页 |
| 5.8.1 NtMYC1a/1b与NtMYC2a/2b启动子序列生物信息学分析 | 第56-59页 |
| 5.8.2 NtMYC1a/1b与NtMYC2a/2b对不同胁迫处理的响应 | 第59页 |
| 6 讨论与结论 | 第59-62页 |
| 6.1 讨论 | 第59-61页 |
| 6.2 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| Abstract | 第68-69页 |
