| 摘要 | 第4-9页 |
| Abstract | 第9-13页 |
| 符号说明 | 第14-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-37页 |
| 1 海豚链球菌的研究现状 | 第20-28页 |
| 1.1 海豚链球菌生物学特性 | 第20页 |
| 1.2 海豚链球菌宿主范围 | 第20-23页 |
| 1.3 海豚链球菌感染后的临床症状和病理表现 | 第23-24页 |
| 1.4 海豚链球菌的致病机理 | 第24页 |
| 1.5 海豚链球菌的主要毒力因子 | 第24-26页 |
| 1.6 海豚链球菌疫苗研究进展 | 第26-28页 |
| 2 鱼类疫苗佐剂研究情况 | 第28-32页 |
| 2.1 盐类佐剂 | 第29页 |
| 2.2 油乳佐剂 | 第29-30页 |
| 2.3 微生物及动物来源佐剂 | 第30-31页 |
| 2.4 细胞因子佐剂 | 第31-32页 |
| 3 鱼类干扰素-γ研究进展 | 第32-35页 |
| 3.1 干扰素分类 | 第32页 |
| 3.2 干扰素-γ功能 | 第32-33页 |
| 3.3 鱼类干扰素-γ分子结构 | 第33-34页 |
| 3.4 鱼类干扰素克隆及功能研究情况 | 第34-35页 |
| 4 本研究的目的与意义 | 第35-37页 |
| 第二章 海豚链球菌α-enolase克隆、表达及生物学功能分析 | 第37-71页 |
| 1 实验材料 | 第38-44页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第38-39页 |
| 1.2 细胞株 | 第39页 |
| 1.3 实验动物 | 第39-40页 |
| 1.4 主要试剂 | 第40-41页 |
| 1.5 主要仪器及设备 | 第41页 |
| 1.6 主要培养基及溶液配制 | 第41-44页 |
| 2 实验方法 | 第44-56页 |
| 2.1 菌株复苏 | 第44-45页 |
| 2.2 细菌基因组DNA提取 | 第45页 |
| 2.3 海豚链球菌α-enolase克隆 | 第45-47页 |
| 2.4 海豚链球菌α-enolase序列生物信息学分析 | 第47页 |
| 2.5 海豚链球菌α-enolase原核表达及重组蛋白纯化 | 第47-51页 |
| 2.6 兔抗海豚链球菌α-enolase多克隆抗体制备及纯化 | 第51-52页 |
| 2.7 海豚链球菌α-enolase在细菌中的定位 | 第52-54页 |
| 2.8 海豚链球菌α-enolase酶活性分析 | 第54页 |
| 2.9 纤溶酶原绑定分析 | 第54-55页 |
| 2.10 α-enolase对海豚链球菌粘附和入侵EPC细胞的影响分析 | 第55-56页 |
| 2.11 统计学分析 | 第56页 |
| 3 实验结果及分析 | 第56-67页 |
| 3.1 PCR扩增及测序 | 第56-57页 |
| 3.2 生物信息学分析 | 第57-59页 |
| 3.3 海豚链球菌α-enolase克隆、原核表达及纯化 | 第59-62页 |
| 3.4 兔抗海豚链球菌rENO抗体制备及抗体效价检测 | 第62页 |
| 3.5 海豚链球菌α-enolase定位 | 第62-65页 |
| 3.6 海豚链球菌α-enolase酶活性分析 | 第65页 |
| 3.7 海豚链球菌α-enolase绑定人纤溶酶原(hPlg)分析 | 第65-66页 |
| 3.8 α-enolase对海豚链球菌粘附和入侵EPC细胞的影响 | 第66-67页 |
| 4 讨论 | 第67-71页 |
| 4.1 海豚链球菌α-enolase表达系统的选择 | 第67-68页 |
| 4.2 海豚链球菌α-enolase既存在于细菌细胞质也存在于细菌表面 | 第68-69页 |
| 4.3 海豚链球菌α-enolase酶活性分析 | 第69-70页 |
| 4.4 海豚链球菌α-enolase绑定人纤溶酶原 | 第70页 |
| 4.5 α-enolase能够影响海豚链球菌粘附和入侵上皮细胞 | 第70-71页 |
| 第三章 重组α-enolase对不同血清型海豚链球菌感染斑点叉尾鮰的交叉免疫保护作用 | 第71-87页 |
| 1 实验材料 | 第72-73页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第72页 |
| 1.2 实验动物 | 第72页 |
| 1.3 主要试剂 | 第72页 |
| 1.4 主要仪器及设备 | 第72-73页 |
| 1.5 主要培养基及溶液配制 | 第73页 |
| 2 实验方法 | 第73-77页 |
| 2.1 菌株复苏 | 第73页 |
| 2.2 细菌基因组DNA提取 | 第73-74页 |
| 2.3 随机扩增片段多态性(RAPD)分析 | 第74页 |
| 2.4 海豚链球菌血清Ⅰ型和Ⅱ型标准菌株α-enolase克隆 | 第74-75页 |
| 2.5 不同血清型海豚链球菌α-enolase氨基酸序列比对 | 第75页 |
| 2.6 western-blot分析 | 第75页 |
| 2.7 重组rENO蛋白大量制备 | 第75页 |
| 2.8 斑点叉尾鮰免疫 | 第75-76页 |
| 2.9 样品采集 | 第76页 |
| 2.10 抗体水平检测 | 第76-77页 |
| 2.11 攻毒 | 第77页 |
| 2.12 统计学分析 | 第77页 |
| 3 实验结果及分析 | 第77-84页 |
| 3.1 RAPD分析 | 第77-78页 |
| 3.2 海豚链球菌α-enolase氨基酸序列多序列比对分析 | 第78-81页 |
| 3.3 western-blot分析 | 第81页 |
| 3.4 抗体水平检测 | 第81-82页 |
| 3.5 免疫保护率分析 | 第82-84页 |
| 4 讨论 | 第84-87页 |
| 4.1 α-enolase在链球菌中具有高度保守性 | 第84-85页 |
| 4.2 海豚连球菌α-enolase交叉免疫保护作用 | 第85-87页 |
| 第四章 重组α-enolase (rENO)与重组斑点叉尾鮰干扰素-γ(rIFN-γ)佐剂疫苗的构建及免疫保护作用研究 | 第87-120页 |
| 1 实验材料 | 第87-90页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第87-88页 |
| 1.2 实验动物 | 第88页 |
| 1.3 主要试剂 | 第88-89页 |
| 1.4 主要仪器及设备 | 第89页 |
| 1.5 主要培养基及溶液配制 | 第89-90页 |
| 2 实验方法 | 第90-101页 |
| 2.1 斑点叉尾鮰IFN-γ克隆 | 第90-93页 |
| 2.2 斑点叉尾鮰IFN-γ生物信息学分析 | 第93页 |
| 2.3 斑点叉尾鮰IFN-γ原核表达及纯化 | 第93-94页 |
| 2.4 western-blot分析 | 第94页 |
| 2.5 斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞分离 | 第94-95页 |
| 2.6 重组IFN-y对斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞的免疫调节作用 | 第95-97页 |
| 2.7 斑点叉尾鮰免疫 | 第97-98页 |
| 2.8 样品采集 | 第98页 |
| 2.9 攻毒及免疫保护率检测 | 第98-99页 |
| 2.10 抗体水平检测 | 第99页 |
| 2.11 ACH50 (Alternative complement haemolysis 50%)活性检测 | 第99-100页 |
| 2.12 溶菌酶活性检测 | 第100页 |
| 2.13 荧光定量PCR检测 | 第100页 |
| 2.14 统计学分析 | 第100-101页 |
| 3 实验结果及分析 | 第101-115页 |
| 3.1 斑点叉尾鮰IFN-γ基因克隆 | 第101页 |
| 3.2 斑点叉尾鮰IFN-γ生物信息学分析 | 第101-102页 |
| 3.3 斑点叉尾鮰IFN-γ重组表达及western-blot分析 | 第102-106页 |
| 3.4 rIFN-γ对斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞的免疫调节作用 | 第106页 |
| 3.5 ACH50活性检测 | 第106-108页 |
| 3.6 溶菌酶活性检测 | 第108-109页 |
| 3.7 抗体水平检测 | 第109-110页 |
| 3.8 免疫保护率检测 | 第110-112页 |
| 3.9 荧光定量PCR检测免疫相关基因表达 | 第112-115页 |
| 4 讨论 | 第115-120页 |
| 4.1 IFN-γ对斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞的激活作用 | 第115-117页 |
| 4.2 rIFN-γ对疫苗的免疫增强作用 | 第117-120页 |
| 第五章 海豚链球菌α-enolase和斑点叉尾鮰IFN-γ串联DNA疫苗的构建及免疫保护效果研究 | 第120-146页 |
| 1 实验材料 | 第120-124页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第120-121页 |
| 1.2 细胞株 | 第121页 |
| 1.3 实验动物 | 第121-122页 |
| 1.4 主要试剂 | 第122页 |
| 1.5 主要仪器及设备 | 第122-123页 |
| 1.6 主要培养基及溶液配制 | 第123-124页 |
| 2 实验方法 | 第124-131页 |
| 2.1 引物设计 | 第124页 |
| 2.2 串联DNA疫苗构建 | 第124-127页 |
| 2.3 去内毒素质粒提取 | 第127页 |
| 2.4 EPC细胞培养及转染 | 第127-128页 |
| 2.5 细胞免疫荧光检测 | 第128页 |
| 2.6 斑点叉尾鮰免疫 | 第128页 |
| 2.7 样品采集 | 第128-129页 |
| 2.8 攻毒及免疫保护率检测 | 第129页 |
| 2.9 免疫组织化学检测 | 第129-130页 |
| 2.10 抗体水平检测 | 第130页 |
| 2.11 ACH50活性检测 | 第130-131页 |
| 2.12 溶菌酶活性检测 | 第131页 |
| 2.13 荧光定量PCR检测 | 第131页 |
| 2.14 统计学分析 | 第131页 |
| 3 实验结果及分析 | 第131-142页 |
| 3.1 pcDNA3.1-ENO、pcDNA3.1-IFN-γ、pcDNA3.1-IFN-γ-ENO重组质粒的构建 | 第131-134页 |
| 3.2 重组真核质粒在EPC细胞中的表达 | 第134页 |
| 3.3 重组真核质粒在斑点叉尾鮰组织中的表达 | 第134-135页 |
| 3.4 ACH50活性检测 | 第135-136页 |
| 3.5 溶菌酶活性检测 | 第136页 |
| 3.6 抗体水平检测 | 第136-138页 |
| 3.7 免疫保护率检测 | 第138-139页 |
| 3.8 荧光定量PCR检测免疫相关基因表达 | 第139-142页 |
| 4 讨论 | 第142-146页 |
| 4.1 串联DNA疫苗的构建 | 第142页 |
| 4.2 串联DNA疫苗的作用机理 | 第142-143页 |
| 4.3 串联DNA疫苗的免疫保护效果 | 第143-146页 |
| 第六章 结论 | 第146-147页 |
| 论文创新点 | 第147-148页 |
| 参考文献 | 第148-161页 |
| 致谢 | 第161-162页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第162页 |
