| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1. 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 猪链球菌和副猪嗜血杆菌流行现状及危害 | 第13-14页 |
| 1.1.1 猪链球菌流行现状及危害 | 第13页 |
| 1.1.2 副猪嗜血杆菌流行现状及危害 | 第13-14页 |
| 1.2 猪链球菌疫苗和副猪嗜血杆菌疫苗的研究进展 | 第14-18页 |
| 1.2.1 猪链球菌疫苗研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.1.1 灭活疫苗 | 第15页 |
| 1.2.1.2 弱毒或无毒活疫苗 | 第15-16页 |
| 1.2.1.3 基因工程亚单位疫苗 | 第16-17页 |
| 1.2.2 副猪嗜血杆菌疫苗研究现状 | 第17-18页 |
| 1.2.2.1 灭活疫苗 | 第17页 |
| 1.2.2.2 弱毒活疫苗 | 第17-18页 |
| 1.2.2.3 基因工程亚单位疫苗 | 第18页 |
| 1.3 基因工程疫苗研究进展 | 第18-21页 |
| 1.3.1 基因工程亚单位疫苗 | 第18-19页 |
| 1.3.2 DNA疫苗 | 第19页 |
| 1.3.3 基因突变或基因缺失疫苗 | 第19-20页 |
| 1.3.4 活载体基因工程疫苗 | 第20-21页 |
| 1.4 伪狂犬病毒基因组作为载体的优势 | 第21-22页 |
| 2. 研究目的及意义 | 第22-23页 |
| 3. 材料及方法 | 第23-37页 |
| 3.1 材料 | 第23-27页 |
| 3.1.1 临床材料 | 第23页 |
| 3.1.2 菌种、毒株及细胞 | 第23页 |
| 3.1.3 载体与质粒 | 第23-24页 |
| 3.1.4 工具酶和生化试剂 | 第24页 |
| 3.1.5 实验动物 | 第24页 |
| 3.1.6 主要仪器 | 第24-25页 |
| 3.1.7 培养基及缓冲液配制 | 第25-26页 |
| 3.1.7.1 培养基 | 第25页 |
| 3.1.7.2 空斑筛选与纯化相关溶液 | 第25页 |
| 3.1.7.3 SDS-PAGE缓冲液与Western blot缓冲液 | 第25-26页 |
| 3.1.7.4 其它缓冲液 | 第26页 |
| 3.1.8 本实验使用的PCR引物 | 第26-27页 |
| 3.2 实验方法 | 第27-37页 |
| 3.2.1 06257、palA、sao及0197基因克隆 | 第27-29页 |
| 3.2.1.1 细菌基因组提取 | 第27-28页 |
| 3.2.1.2 PCR扩增目的基因 | 第28页 |
| 3.2.1.3 PCR产物回收及纯化 | 第28-29页 |
| 3.2.1.4 目的基因TA克隆及测序 | 第29页 |
| 3.2.2 转移载体pIE/06257/0197及pIE/palA/Sao的构建 | 第29-31页 |
| 3.2.2.1 质粒的提取 | 第29页 |
| 3.2.2.2 酶切及连接 | 第29-31页 |
| 3.2.3 亲本毒株(PRV TK~-/gE~-/LacZ~+)病毒基因组的提取 | 第31页 |
| 3.2.4 脂质体介导的共转染 | 第31-32页 |
| 3.2.5 重组病毒的空斑筛选及纯化 | 第32-33页 |
| 3.2.5.1 共转染产物的空斑实验 | 第32页 |
| 3.2.5.2 PCR鉴定模板的处理 | 第32页 |
| 3.2.5.3 重组病毒的PCR筛选与外源基因遗传稳定性检测 | 第32-33页 |
| 3.2.6 反转录PCR(RT-PCR)鉴定 | 第33页 |
| 3.2.7 重组病毒的TCID_(50)测定 | 第33-34页 |
| 3.2.8 SDS-PAGE | 第34页 |
| 3.2.9 Western blot | 第34页 |
| 3.2.10 间接免疫荧光 | 第34-35页 |
| 3.2.11 疫苗免疫效果评价 | 第35-36页 |
| 3.2.11.1 小鼠实验分组及处理 | 第35页 |
| 3.2.11.2 ELISA检测抗体 | 第35-36页 |
| 3.2.11.3 PRV中和抗体测定 | 第36页 |
| 3.2.12 冻干疫苗的制备 | 第36页 |
| 3.2.13 疫苗的安全性试验 | 第36-37页 |
| 3.2.13.1 实验室安全性试验 | 第36页 |
| 3.2.13.2 猪场安全性试验 | 第36-37页 |
| 4. 结果与分析 | 第37-56页 |
| 4.1 猪链球菌和副猪嗜血杆菌在猪场的流行及发病调查 | 第37-41页 |
| 4.1.1 猪链球菌和副猪嗜血杆菌在猪场的流行情况分析 | 第37-39页 |
| 4.1.2 猪场育肥猪猪链球菌发病案例 | 第39页 |
| 4.1.3 猪场猪链球菌母猪繁殖障碍发病案例 | 第39-40页 |
| 4.1.4 猪场保育猪副猪嗜血杆菌发病案例 | 第40-41页 |
| 4.1.5 分析和展望 | 第41页 |
| 4.2 重组病毒疫苗的构建 | 第41-46页 |
| 4.2.1 转移载体的构建 | 第41-42页 |
| 4.2.2 转移载体与亲本基因组共转染 | 第42-43页 |
| 4.2.3 重组病毒的空斑纯化 | 第43-45页 |
| 4.2.4 重组病毒的纯度检测 | 第45-46页 |
| 4.3 重组病毒的鉴定及其生物学特性 | 第46-50页 |
| 4.3.1 重组病毒的RT-PCR检测 | 第46页 |
| 4.3.2 间接免疫荧光检测重组病毒外源基因的表达 | 第46-47页 |
| 4.3.3 Western blot检测重组病毒外源蛋白的表达 | 第47-48页 |
| 4.3.4 重组病毒与亲本毒在PK-15细胞上的增殖特性比较 | 第48-49页 |
| 4.3.5 重组病毒的遗传稳定性检测 | 第49-50页 |
| 4.4 小鼠体内疫苗免疫效果评价 | 第50-52页 |
| 4.4.1 免疫程序 | 第50页 |
| 4.4.2 抗猪链球菌、副猪嗜血杆菌外源蛋白的小鼠血清ELISA抗体的检测 | 第50-51页 |
| 4.4.3 小鼠血清抗PRV中和抗体检测 | 第51-52页 |
| 4.4.4 免疫小鼠的攻毒保护试验 | 第52页 |
| 4.5 重组病毒基因工程疫苗的制备 | 第52-53页 |
| 4.5.1 冻干后的质量检验 | 第53页 |
| 4.5.2 疫苗冻干前后毒价的比较 | 第53页 |
| 4.6 重组病毒疫苗的安全性试验 | 第53-55页 |
| 4.6.1 重组病毒疫苗对仔猪的实验室安全性试验 | 第53-54页 |
| 4.6.2 重组病毒疫苗的规模化猪场安全性试验 | 第54-55页 |
| 4.7 针对特定猪场SS、HPS及PRV阳性猪群的免疫程序的制定和实施 | 第55-56页 |
| 5. 讨论 | 第56-59页 |
| 6. 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
