| 致谢 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9页 |
| 第一章 绪论 | 第16-22页 |
| 1.1 肝素及其现状 | 第16页 |
| 1.2 肝素前体 | 第16-17页 |
| 1.3 合成肝素前体的菌株 | 第17-18页 |
| 1.4 合成、转运肝素前体的酶及表达调控 | 第18-19页 |
| 1.5 肝素前体产量的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.6 研究内容、目的及意义 | 第20-22页 |
| 1.6.1 研究内容 | 第20-21页 |
| 1.6.2 研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 第二章 荚膜多糖PAGE电泳 | 第22-25页 |
| 2.1 材料与方法 | 第22-24页 |
| 2.1.1 主要仪器耗材 | 第22页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 提取MM平板上的肝素前体 | 第22页 |
| 2.1.4 荚膜多糖PAGE分析 | 第22-24页 |
| 2.1.4.1 主要仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.4.2 主要试剂 | 第23页 |
| 2.1.4.3 制备荚膜多糖PAGE凝胶 | 第23页 |
| 2.1.4.4 电泳 | 第23页 |
| 2.1.4.5 染色脱色 | 第23-24页 |
| 2.2 实验结果 | 第24页 |
| 2.2.1 不同碳源对EcN合成肝素前体的影响 | 第24页 |
| 2.3 讨论 | 第24-25页 |
| 第三章 region3启动子转录调控的研究 | 第25-60页 |
| 3.1 材料与方法 | 第25-46页 |
| 3.1.1 主要仪器耗材 | 第25页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第25-27页 |
| 3.1.3 化学感受态细胞的制备及化学转化 | 第27-28页 |
| 3.1.3.1 化学感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 3.1.3.2 化学转化 | 第28页 |
| 3.1.4 电击转化感受态细胞的制备及电击转化 | 第28-29页 |
| 3.1.4.1 电击转化感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| 3.1.4.2 电击转化 | 第29页 |
| 3.1.5 敲除EcN中lacZ基因 | 第29-32页 |
| 3.1.6 EcN和EcN△lacZ的β-半乳糖苷酶活性分析 | 第32-33页 |
| 3.1.6.1 试剂配制 | 第32-33页 |
| 3.1.6.2 反应方法 | 第33页 |
| 3.1.7 启动子融合质粒的构建 | 第33-35页 |
| 3.1.7.1 PCR扩增kpsM启动子序列 | 第33页 |
| 3.1.7.2 SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化kpsM启动子 | 第33-34页 |
| 3.1.7.3 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒pAH125 | 第34页 |
| 3.1.7.4 酶切处理kpsM启动子和质粒pAH125 | 第34-35页 |
| 3.1.7.5 酶切产物连接与转化 | 第35页 |
| 3.1.7.6 BW25142/pAH125-kpsMP菌落PCR | 第35页 |
| 3.1.7.7 提取质粒pAH125-kpsMP | 第35页 |
| 3.1.8 构建新的启动子融合质粒pFZY1-kpsMP | 第35-37页 |
| 3.1.8.1 提取质粒pFZY1 | 第35页 |
| 3.1.8.2 构建质粒pFZY1-kpsMP | 第35-36页 |
| 3.1.8.3 Top10/pFZY1-kpsMP菌落PCR | 第36-37页 |
| 3.1.9 β-半乳糖苷酶活性分析 | 第37页 |
| 3.1.10 敲除EcN△lacZ中crp基因 | 第37-40页 |
| 3.1.10.1 PCR扩增带同源臂的FRT-cat-FRT | 第37-38页 |
| 3.1.10.2 敲除ZK126中crp基因 | 第38页 |
| 3.1.10.3 ZK126中β-半乳糖苷酶活性分析 | 第38页 |
| 3.1.10.4 敲除ZK126中cya基因 | 第38-39页 |
| 3.1.10.5 回补ZK126△crp::cat中crp基因 | 第39-40页 |
| 3.1.10.6 回补ZK126△cya::cat中cya基因 | 第40页 |
| 3.1.10.7 回补菌株β-半乳糖苷酶活性分析 | 第40页 |
| 3.1.11 构建crp基因表达质粒并表达CRP蛋白 | 第40-43页 |
| 3.1.11.1 PCR扩增crp基因 | 第40-41页 |
| 3.1.11.2 DNA片段纯化 | 第41页 |
| 3.1.11.3 酶切片段crp和质粒pET28a(+) | 第41页 |
| 3.1.11.4 连接与转化 | 第41页 |
| 3.1.11.5 DH5α/pET28a-crp菌落PCR | 第41-42页 |
| 3.1.11.6 转化至表达菌株 | 第42页 |
| 3.1.11.7 CRP蛋白表达、纯化 | 第42-43页 |
| 3.1.11.8 纯化的CRP蛋白透析 | 第43页 |
| 3.1.12 EMSA实验 | 第43-45页 |
| 3.1.12.1 引物退火成双链DNA探针 | 第43页 |
| 3.1.12.2 确定探针的标记效率 | 第43-44页 |
| 3.1.12.3 CRP蛋白与探针结合反应 | 第44-45页 |
| 3.1.13 突变启动子融合质粒的构建 | 第45页 |
| 3.1.14 突变启动子质粒半乳糖苷酶活性的研究 | 第45-46页 |
| 3.2 实验结果 | 第46-58页 |
| 3.2.1 EcN△lacZ::kan菌落PCR | 第46页 |
| 3.2.2 去除kan抗性片段 | 第46-47页 |
| 3.2.3 β-半乳糖苷酶活性分析 | 第47-48页 |
| 3.2.4 构建新的启动子融合质粒pFZY1-kpsMP | 第48-49页 |
| 3.2.4.1 Top10/pFZY1-kpsMP菌落PCR | 第48页 |
| 3.2.4.2 酶切检验融合质粒pFZY1-kpsMP | 第48-49页 |
| 3.2.5 EcN△lacZ中β-半乳糖苷酶活性分析 | 第49页 |
| 3.2.6 敲除crp基因 | 第49-50页 |
| 3.2.6.1 EcN△lacZAcrp::cat菌落PCR | 第49页 |
| 3.2.6.2 ZK126△crp::cat菌落PCR | 第49-50页 |
| 3.2.7 肝素前体的合成受代谢产物的抑制 | 第50-51页 |
| 3.2.8 ZK126△cya::cat菌落PCR | 第51页 |
| 3.2.9 crp和cya敲除株基因回补 | 第51-53页 |
| 3.2.9.1 回补ZK126中crp基因 | 第51-52页 |
| 3.2.9.2 回补ZK126中cya基因 | 第52-53页 |
| 3.2.10 回补crp和cya基因恢复region3启动的表达 | 第53-55页 |
| 3.2.11 crp表达质粒pET28a-crp的构建 | 第55-56页 |
| 3.2.12 CRP蛋白表达 | 第56-57页 |
| 3.2.13 cAMP-CRP复合物直接结合在region3启动子的CRP结合位点上,并促进转录 | 第57-58页 |
| 3.2.13.1 凝胶缓滞实验(EMSA) | 第57页 |
| 3.2.13.2 突变region3启动子的β-半乳糖苷酶活性分析 | 第57-58页 |
| 3.3 讨论 | 第58-60页 |
| 第四章 不同碳源对肝素前体合成的影响 | 第60-64页 |
| 4.1 材料与方法 | 第60-61页 |
| 4.1.1 主要仪器 | 第60页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第60页 |
| 4.1.3 提取液体培养基上清中的肝素前体 | 第60-61页 |
| 4.1.4 ~1H NMR分析 | 第61页 |
| 4.2 实验结果 | 第61-63页 |
| 4.2.1 crp敲除株不表达肝素前体 | 第61-62页 |
| 4.2.2 用果糖或甘露糖替换葡萄糖增加肝素前体的产量 | 第62-63页 |
| 4.3 讨论 | 第63-64页 |
| 第五章 总结 | 第64-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 | 第72页 |
