| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1. 绪论 | 第8-16页 |
| 1.1 表观遗传学与组蛋白修饰 | 第8-9页 |
| 1.2 组蛋白赖氨酸甲基化 | 第9页 |
| 1.3 Set2蛋白与H3K36甲基化 | 第9-11页 |
| 1.4 蛋白质泛素化与E3连接酶 | 第11-12页 |
| 1.5 蛋白质磷酸化与Bur1/Bur2蛋白激酶 | 第12-13页 |
| 1.6 系统遗传矩阵方法(SGA) | 第13-14页 |
| 1.7 研究思路和意义 | 第14-16页 |
| 2. 材料与方法 | 第16-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第16-24页 |
| 2.1.1 菌株 | 第16-17页 |
| 2.1.2 质粒 | 第17页 |
| 2.1.3 引物 | 第17-19页 |
| 2.1.4 药品试剂 | 第19-21页 |
| 2.1.5 工具酶和试剂盒 | 第21页 |
| 2.1.6 抗体 | 第21-22页 |
| 2.1.7 实验仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.8 实验耗材及常用物品 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-48页 |
| 2.2.1 配制酵母及大肠杆菌生长培养基 | 第24-25页 |
| 2.2.2 制备DH5α/TOP10/BL21菌株感受态细胞 | 第25-26页 |
| 2.2.3 构建重组载体 | 第26-30页 |
| 2.2.4 同源重组方法在酵母菌株中敲除基因 | 第30-31页 |
| 2.2.5 酵母菌株中转入质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.6 CHX处理蛋白降解实验 | 第32-33页 |
| 2.2.7 SGA法筛选双突变菌株 | 第33-34页 |
| 2.2.8 Western Blot(蛋白质免疫印迹) | 第34-36页 |
| 2.2.9 DOX处理tet启动子突变株实验 | 第36页 |
| 2.2.10 RT-qPCR(反转录定量PCR) | 第36-37页 |
| 2.2.11 MB-PP1处理as突变株实验 | 第37页 |
| 2.2.12 Co-immunoprecipitation (免疫共沉淀，Co-IP) | 第37-38页 |
| 2.2.13 体内IP泛素化反应 | 第38-39页 |
| 2.2.14 大肠杆菌纯化CBP标签蛋白 | 第39-41页 |
| 2.2.15 昆虫表达载体SF9细胞纯化His标签蛋白 | 第41-45页 |
| 2.2.16 体外磷酸化反应 | 第45页 |
| 2.2.17 质谱鉴定磷酸化蛋白位点 | 第45-46页 |
| 2.2.18 点突变 | 第46-47页 |
| 2.2.19 药物处理酵母细胞周期实验 | 第47页 |
| 2.2.20 酵母生长梯度稀释实验 | 第47-48页 |
| 2.3 实验过程 | 第48-50页 |
| 2.3.1 筛选Set2的E3连接酶 | 第48页 |
| 2.3.2 证明Bre1是Set2的E3连接酶 | 第48页 |
| 2.3.3 检测Bur1/Bur2调控Se2的机制是否与Ctk1不同 | 第48-49页 |
| 2.3.4 检测Bur1/Bur2是否直接磷酸化Se2 | 第49页 |
| 2.3.5 探究磷酸化的功能 | 第49-50页 |
| 3. 结果与讨论 | 第50-66页 |
| 3.1 Bre1是Set2蛋白的E3连接酶 | 第50-52页 |
| 3.1.1 CHX实验证明Set2蛋白由蛋白酶体途径降解 | 第50页 |
| 3.1.2 SGA方法筛选E3连接酶可能为Bre1 | 第50-52页 |
| 3.2 进一步证明Bre1是Set2的E3连接酶 | 第52-55页 |
| 3.2.1 敲除BRE1可以恢复Set2蛋白水平 | 第52-53页 |
| 3.2.2 回转Bre1或过表达Bre1降低Set2蛋白水平 | 第53页 |
| 3.2.3 Co-IP实验证明Bre1与Set2有相互作用 | 第53-54页 |
| 3.2.4 酵母细胞中用Ni-NTA柱pull-down蛋白后检测到泛素化信号 | 第54-55页 |
| 3.3 Bur1/Bur2调控Se2的机制与Ctk1不同 | 第55-58页 |
| 3.3.1 ctk1△或bur2△都会降低Set2蛋白水平 | 第55-57页 |
| 3.3.2 Bur2调控Set2的机制与Ck1的调控机制不同 | 第57页 |
| 3.3.3 BUR1-as与bur2△菌株中影响Se2蛋白水平的表型一致 | 第57-58页 |
| 3.4 Bur1/Bur2可以在体外直接磷酸化Se2 | 第58-59页 |
| 3.5 Bur1/Bur2对Set2的磷酸化对于H3K36甲基化是必需的 | 第59-62页 |
| 3.5.1 三个较近的磷酸化位点一起负责Bur1/Bur2对Set2的磷酸化作用及下游的H3K36甲基化功能 | 第59-60页 |
| 3.5.2 Bur1/Bur2对Set2的磷酸化作用对于H3K36me2/me3是必需的 | 第60-62页 |
| 3.6 Bur1/Bur2对Set2的磷酸化对于Set2的蛋白稳定性是必需的 | 第62-63页 |
| 3.7 Bur1/Bur2对Set2的磷酸化与细胞周期和DNA损伤修复相关 | 第63-66页 |
| 3.7.1 Bur1/Bur2对Set2的磷酸化与细胞周期相关 | 第63-64页 |
| 3.7.2 Bur1/Bur2对Set2的磷酸化与DNA损伤修复相关 | 第64-66页 |
| 4. 总结与展望 | 第66-68页 |
| 4.1 总结 | 第66-67页 |
| 4.2 展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 英文缩略表 | 第72-74页 |
| 己发表学术论文 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
