| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 引言 | 第12-20页 |
| 1.1 防御素概述 | 第12-17页 |
| 1.1.1 防御素的分类 | 第12-13页 |
| 1.1.2 防御素的生物学活性 | 第13-14页 |
| 1.1.3 防御素作用机理 | 第14-15页 |
| 1.1.4 防御素基因的重组表达 | 第15-17页 |
| 1.1.5 防御素的应用 | 第17页 |
| 1.2 研究内容和技术路线 | 第17-18页 |
| 1.2.1 研究内容 | 第17-18页 |
| 1.2.2 技术路线 | 第18页 |
| 1.3 研究目的与意义 | 第18页 |
| 1.4 研究目标 | 第18-19页 |
| 技术路线 | 第19-20页 |
| 2 材料 | 第20-26页 |
| 2.1 毒株、菌株与载体 | 第20页 |
| 2.2 实验用动物 | 第20页 |
| 2.3 主要试剂 | 第20-24页 |
| 2.3.1 RNA 提取试剂 | 第20页 |
| 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液 | 第20-21页 |
| 2.3.3 琼脂糖凝胶电泳用溶液 | 第21页 |
| 2.3.4 诱导表达用液 | 第21页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE 电泳用溶液 | 第21-22页 |
| 2.3.6 蛋白纯化回收和脱盐用液 | 第22页 |
| 2.3.7 Western blot 用液 | 第22-23页 |
| 2.3.8 细胞培养用溶液 | 第23-24页 |
| 2.3.9 其它试剂 | 第24页 |
| 2.4 主要仪器 | 第24-26页 |
| 3 方法 | 第26-37页 |
| 3.1 引物设计与合成 | 第26页 |
| 3.2 猪β-防御素-1 前体基因克隆载体的构建和鉴定 | 第26-29页 |
| 3.2.1 猪总 RNA 分离提取 | 第26页 |
| 3.2.2 RT-PCR | 第26-27页 |
| 3.2.3 猪β-防御素-1 前体基因 PCR 产物的纯化和回收 | 第27页 |
| 3.2.4 猪β-防御素-1 前体基因和 pGM-T 载体的连接 | 第27页 |
| 3.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备-CaCl2法 | 第27-28页 |
| 3.2.6 重组质粒的转化 | 第28页 |
| 3.2.7 重组质粒 DNA 的提取 | 第28页 |
| 3.2.8 重组质粒酶切鉴定 | 第28页 |
| 3.2.9 重组质粒 pGM-T-PBD-1 序列测定 | 第28-29页 |
| 3.3 猪β-防御素-1 成熟肽基因表达载体的构建与鉴定 | 第29-31页 |
| 3.3.1 猪β-防御素-1 成熟肽基因 PCR 扩增和纯化回收 | 第29页 |
| 3.3.2 猪β-防御素-1 成熟肽基因和表达载体 PET-32a(+)的酶切 | 第29-30页 |
| 3.3.3 猪β-防御素-1 成熟肽基因和 PET-32a(+)载体的连接 | 第30页 |
| 3.3.4 重组表达载体 PET-32a(+)-PBD-1 的转化和质粒提取 | 第30页 |
| 3.3.5 重组表达载体 PET-32a(+)-PBD-1 的鉴定 | 第30-31页 |
| 3.3.6 大肠杆菌感受态细胞 BL21 的制备 | 第31页 |
| 3.3.7 重组表达载体 PET-32a(+)-PBD-1 转化 | 第31页 |
| 3.4 重组表达菌的诱导表达 | 第31-32页 |
| 3.4.1 重组表达菌的诱导表达 | 第31页 |
| 3.4.2 最佳表达条件的确定 | 第31-32页 |
| 3.4.3 重组 PBD-1 的可溶性检测 | 第32页 |
| 3.5 重组猪β-防御素-1 的纯化回收和脱盐 | 第32-33页 |
| 3.5.1 纯化回收 | 第32-33页 |
| 3.5.2 凝胶过滤法脱盐 | 第33页 |
| 3.5.3 冷冻干燥 | 第33页 |
| 3.6 重组猪β-防御素-1 的 Western blot 鉴定 | 第33-34页 |
| 3.7 重组猪β-防御素-1 的抗微生物活性检测 | 第34-35页 |
| 3.7.1 抗菌活性检测 | 第34页 |
| 3.7.2 抗病毒活性检测 | 第34-35页 |
| 3.8 动物试验 | 第35-37页 |
| 3.8.1 试验动物分组与感染 | 第35页 |
| 3.8.2 治疗 | 第35-36页 |
| 3.8.3 肉眼病变检测 | 第36页 |
| 3.8.4 显微镜检测 | 第36-37页 |
| 4 结果与分析 | 第37-58页 |
| 4.1 猪β-防御素-1 基因的克隆 | 第37-38页 |
| 4.1.1 猪β-防御素-1 全基因的 PCR 扩增 | 第37页 |
| 4.1.2 猪β-防御素-1 克隆载体 pGM-T-PBD-1 的鉴定 | 第37-38页 |
| 4.1.3 序列测定结果 | 第38页 |
| 4.2 猪β-防御素-1 重组表达载体 PET-32a-PBD-1 的构建 | 第38-39页 |
| 4.3 重组猪β-防御素-1 的表达及其最佳表达条件 | 第39-42页 |
| 4.3.1 重组猪β-防御素-1 的表达 | 第39页 |
| 4.3.2 最佳表达条件 | 第39-41页 |
| 4.3.3 表达产物以包涵体形式存在 | 第41-42页 |
| 4.4 表达产物的纯化和脱盐回收 | 第42-44页 |
| 4.4.1 纯化 | 第42-43页 |
| 4.4.2 脱盐回收 | 第43页 |
| 4.4.3 冷冻干燥 | 第43-44页 |
| 4.5 重组猪β-防御素-1 的 Western blot 鉴定 | 第44-45页 |
| 4.6 重组猪β-防御素-1 抗微生物活性 | 第45-51页 |
| 4.6.1 对常见细菌具有抑制活性 | 第45-50页 |
| 4.6.2 对 PEDV 和禽流感病毒 H9N2 具有抑制活性 | 第50-51页 |
| 4.7 动物试验 | 第51-58页 |
| 4.7.1 临床症状 | 第51-52页 |
| 4.7.2 体重 | 第52-53页 |
| 4.7.3 感染率和死亡率 | 第53-54页 |
| 4.7.4 病理变化 | 第54-55页 |
| 4.7.5 病原分离与鉴定 | 第55-58页 |
| 5 讨论 | 第58-61页 |
| 5.1 重组 PBD-1 克隆、表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 5.2 重组 PBD-1 的表达、纯化、脱盐和冷冻干燥处理 | 第59页 |
| 5.3 重组 PBD-1 体外试验 | 第59-60页 |
| 5.4 动物试验 | 第60-61页 |
| 6 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-66页 |
| 在读期间发表的学术论文及获得的奖励 | 第66-67页 |
| 作者简介 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
