| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 绪论 | 第13-24页 |
| 1 甘蔗主要细菌性病害及其危害 | 第13-15页 |
| 1.1 甘蔗宿根矮化病 | 第13-14页 |
| 1.2 甘蔗赤条病 | 第14页 |
| 1.3 甘蔗白条病 | 第14-15页 |
| 1.4 甘蔗流胶病 | 第15页 |
| 1.5 甘蔗心腐病 | 第15页 |
| 2 植物病原菌检测技术及其应用 | 第15-20页 |
| 2.1 血清学检测技术 | 第16-17页 |
| 2.1.1 酶联免疫技术 | 第16页 |
| 2.1.2 免疫荧光技术 | 第16页 |
| 2.1.3 斑点免疫结合技术 | 第16页 |
| 2.1.4 免疫PCR技术(immuno PCR,I-PCR) | 第16-17页 |
| 2.1.5 免疫毛细管区带电泳技术(immuno Capillary Zone Electrophoresis,I-CZE) | 第17页 |
| 2.2 基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的检测技术 | 第17-19页 |
| 2.2.1 rDNA-PCR | 第17页 |
| 2.2.2 ITS-PCR(转录间隔区——PCR) | 第17页 |
| 2.2.3 tDNA-PCR | 第17页 |
| 2.2.4 PCR-单链构型多态性(PCR single-strand conformational polymorphism,PCR-SSCP) | 第17-18页 |
| 2.2.5 定量PCR(quantitative-PCR,Q-PCR) | 第18页 |
| 2.2.6 反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR) | 第18-19页 |
| 2.2.7 基于PCR的基因多态性检测技术 | 第19页 |
| 2.3 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP) | 第19-20页 |
| 2.4 基因芯片技术(gene chip) | 第20页 |
| 3 甘蔗宿根矮化病菌检测技术研究进展 | 第20-22页 |
| 3.1 显微镜技术 | 第20-21页 |
| 3.2 血清学技术 | 第21页 |
| 3.3 PCR技术 | 第21页 |
| 3.4 Southern杂交 | 第21-22页 |
| 4 本论文研究 | 第22-24页 |
| 4.1 本研究的目的和意义 | 第22页 |
| 4.2 本论文主要研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 甘蔗宿根矮化病菌的分离、鉴定及多克隆抗体制备 | 第24-43页 |
| 1 材料与方法 | 第24-32页 |
| 1.1 实验材料 | 第24-26页 |
| 1.1.1 目标菌株来源 | 第24页 |
| 1.1.2 同属近缘菌株的来源 | 第24页 |
| 1.1.3 主要仪器设备和试剂 | 第24-26页 |
| 1.1.4 引物 | 第26页 |
| 1.2 实验方法 | 第26-32页 |
| 1.2.1 蔗汁中细菌的分离培养 | 第26-27页 |
| 1.2.1.1 甘蔗宿根矮化病病原菌的分离培养 | 第26-27页 |
| 1.2.1.2 蔗汁中其它细菌的分离培养 | 第27页 |
| 1.2.2 甘蔗宿根矮化病菌的显微镜鉴定 | 第27页 |
| 1.2.2.1 正置相差显微镜观察 | 第27页 |
| 1.2.2.2 透射式电子显微镜观察 | 第27页 |
| 1.2.3 甘蔗宿根矮化病菌的PCR鉴定 | 第27页 |
| 1.2.4 甘蔗宿根矮化病菌的菌液纯度鉴定 | 第27-28页 |
| 1.2.4.1 基于真菌通用引物的检测 | 第27-28页 |
| 1.2.4.2 基于细菌通用引物的检测 | 第28页 |
| 1.2.5 目的片段的回收、克隆与测序 | 第28-30页 |
| 1.2.5.1 目的片段的回收 | 第28-29页 |
| 1.2.5.2 产物与载体的连接 | 第29页 |
| 1.2.5.3 连接产物转化大肠杆菌 | 第29页 |
| 1.2.5.4 重组子的PCR鉴定 | 第29-30页 |
| 1.2.5.5 序列分析 | 第30页 |
| 1.2.6 多克隆抗体的制备 | 第30-31页 |
| 1.2.6.1 免疫原的制备 | 第30页 |
| 1.2.6.2 免疫过程 | 第30-31页 |
| 1.2.7 抗反应浓度的确定试验 | 第31-32页 |
| 1.2.7.1 抗原材料处理 | 第31页 |
| 1.2.7.2 DB-EIA清反应 | 第31-32页 |
| 1.2.8 一抗特异性验证 | 第32页 |
| 1.2.8.1 筛选蔗汁中的赖氏细菌 | 第32页 |
| 1.2.8.2 赖氏菌属模式菌株的恢复培养 | 第32页 |
| 1.2.8.3 一抗特异性验证 | 第32页 |
| 2 结果与分析 | 第32-43页 |
| 2.1 甘蔗宿根矮化病菌的分离培养和形态学鉴定 | 第32-34页 |
| 2.2 甘蔗宿根矮化病菌特异引物的PCR鉴定与产物测序 | 第34-35页 |
| 2.3 甘蔗宿根矮化病菌菌液的纯度鉴定 | 第35-37页 |
| 2.4 蔗汁中赖氏细菌的筛选结果 | 第37-38页 |
| 2.5 甘蔗宿根矮化病菌菌体蛋白提取效果 | 第38-39页 |
| 2.6 兔血清的效价测试结果 | 第39页 |
| 2.7 一抗反应浓度的确定 | 第39-40页 |
| 2.8 一抗特异性验证结果 | 第40-43页 |
| 第三章 甘蔗宿根矮化病菌分子检测技术(PCR和LAMP) | 第43-58页 |
| 1 材料与方法 | 第43-47页 |
| 1.1 实验材料 | 第43页 |
| 1.1.1 植物材料 | 第43页 |
| 1.1.2 质粒 | 第43页 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 | 第43-44页 |
| 1.3 实验方法 | 第44-47页 |
| 1.3.1 取样 | 第44页 |
| 1.3.2 DNA提取 | 第44-45页 |
| 1.3.3 PCR检测 | 第45页 |
| 1.3.4 PCR检测灵敏度试验 | 第45页 |
| 1.3.5 LAMP引物设计与合成 | 第45-46页 |
| 1.3.6 LAMP检测条件的优化及检测体系的建立 | 第46页 |
| 1.3.7 LAMP反应最佳引物浓度比和最佳Mg~(2+)浓度的确定 | 第46-47页 |
| 1.3.8 LAMP和PCR检测灵敏度试验 | 第47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-58页 |
| 2.1 DNA质量检测 | 第47页 |
| 2.2 节间蔗汁总DNA和叶片中脉总DNA的PCR检测结果 | 第47-49页 |
| 2.3 节间蔗汁总DNA和叶中脉总DNA的PCR检测灵敏度试验 | 第49-52页 |
| 2.4 LAMP反应体系的优化 | 第52-56页 |
| 2.4.1 内外引物浓度比的确定 | 第52-53页 |
| 2.4.2 Mg~(2+)浓度的确定 | 第53-56页 |
| 2.5 LAMP检测方法的建立 | 第56页 |
| 2.6 LAMP和PCR灵敏度比较的结果 | 第56-58页 |
| 第四章 讨论与结论 | 第58-63页 |
| 1 讨论 | 第58-61页 |
| 1.1 关于甘蔗宿根矮化病病原菌分离培养的技术关键 | 第58页 |
| 1.2 关于血清学检测技术中存在的问题 | 第58-59页 |
| 1.3 对PCR检测技术中存在问题的探讨 | 第59-60页 |
| 1.4 LAMP检测技术的优越性及技术关键 | 第60-61页 |
| 2 结论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 附录Ⅰ 缩写词 | 第71-72页 |
| 附录Ⅱ 培养基与主要试剂的配制 | 第72-75页 |
| 附录Ⅲ 蔗汁中部分赖氏细菌的核苷酸序列 | 第75-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
