| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 缩略词表 | 第6-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 溶菌酶概述 | 第11页 |
| 1.2 溶菌酶的作用机理及分类 | 第11-14页 |
| 1.2.1 c型溶菌酶 | 第12页 |
| 1.2.2 g型溶菌酶 | 第12页 |
| 1.2.3 i型溶菌酶 | 第12-13页 |
| 1.2.4 植物溶菌酶 | 第13页 |
| 1.2.5 微生物溶菌酶 | 第13页 |
| 1.2.6 噬菌体溶菌酶 | 第13-14页 |
| 1.3 溶菌酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.3.1 在医药领域的应用 | 第14页 |
| 1.3.2 在食品领域的应用 | 第14页 |
| 1.3.3 在农业领域的应用 | 第14页 |
| 1.3.4 在科学领域的应用 | 第14-15页 |
| 1.4 利用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展 | 第15-19页 |
| 1.4.1 发酵条件控制对毕赤酵母高密度发酵的影响 | 第16-18页 |
| 1.4.1.1 培养基种类及配方对细胞发酵密度的影响 | 第16页 |
| 1.4.1.2 温度对毕赤酵母高密度发酵的影响 | 第16-17页 |
| 1.4.1.3 pH对毕赤酵母高密度发酵的影响及调控 | 第17-18页 |
| 1.4.2 诱导控制方法对毕赤酵母表达外源基因的影响 | 第18-19页 |
| 1.4.2.1 恒溶氧诱导 | 第18页 |
| 1.4.2.2 恒比生长速率诱导 | 第18页 |
| 1.4.2.3 恒甲醇浓度诱导 | 第18-19页 |
| 1.4.3 毕赤酵母高密度发酵过程中存在的问题 | 第19页 |
| 1.5 研究的主要内容、目的、意义和技术路线 | 第19-21页 |
| 1.5.1 研究的主要内容 | 第19页 |
| 1.5.2 研究的目的 | 第19页 |
| 1.5.3 研究的意义 | 第19页 |
| 1.5.4 技术路线 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-37页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第21-27页 |
| 2.1.1 组织材料 | 第21页 |
| 2.1.2 菌种与质粒 | 第21页 |
| 2.1.3 限制性内切酶与试剂盒 | 第21页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第21-24页 |
| 2.1.6 培养基的制备 | 第24-26页 |
| 2.1.7 主要仪器 | 第26-27页 |
| 2.2 海洋生物溶菌酶基因片段的扩增 | 第27-30页 |
| 2.2.1 设计合成特异性引物 | 第27页 |
| 2.2.1.1 设计合成牡蛎溶菌酶特异性引物 | 第27页 |
| 2.2.1.2 海参溶菌酶的特异性引物由实验室提供 | 第27页 |
| 2.2.2 提取牡蛎组织的总RNA | 第27-28页 |
| 2.2.2.1 实验预处理 | 第27-28页 |
| 2.2.2.2 牡蛎组织样品的处理 | 第28页 |
| 2.2.2.3 牡蛎总RNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.2.4 牡蛎总RNA沉淀的清洗 | 第28页 |
| 2.2.2.5 牡蛎总RNA沉淀的溶解 | 第28页 |
| 2.2.3 RT-PCR法扩增CgLys | 第28-30页 |
| 2.2.3.1 RT-PCR反应体系 | 第28-29页 |
| 2.2.3.2 RT-PCR反应条件 | 第29-30页 |
| 2.2.3.3 RT-PCR产物的回收 | 第30页 |
| 2.3 海洋生物溶菌酶的基因亚克隆 | 第30-33页 |
| 2.3.1 牡蛎溶菌酶的基因亚克隆 | 第30-33页 |
| 2.3.1.1 构建重组克隆质粒pMD18-T-CgLys并转化至E.coli DH5α | 第30-31页 |
| 2.3.1.2 菌落PCR法鉴定阳性菌株 | 第31-32页 |
| 2.3.1.3 双酶切法鉴定阳性菌株 | 第32页 |
| 2.3.1.4 测序法鉴定阳性菌株 | 第32-33页 |
| 2.3.2 海参溶菌酶基因的亚克隆 | 第33页 |
| 2.4 海洋生物溶菌酶重组毕赤酵母的构建与表达 | 第33-37页 |
| 2.4.1 重组表达质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.4.1.1 双酶切重组克隆质粒和空表达载体 | 第33页 |
| 2.4.1.2 酶切产物的回收 | 第33-34页 |
| 2.4.1.3 重组表达质粒的构建及转化E.coli DH5 α | 第34页 |
| 2.4.2 海洋生物溶菌酶重组毕赤酵母的构建 | 第34-35页 |
| 2.4.2.1 制备毕赤酵母GS115感受态细胞 | 第34-35页 |
| 2.4.2.2 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的电转化 | 第35页 |
| 2.4.2.3 阳性转化子的筛选 | 第35页 |
| 2.4.2.4 高拷贝阳性菌株的筛选 | 第35页 |
| 2.4.3 筛选具有溶菌酶活性的基因工程菌 | 第35-36页 |
| 2.4.4 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第37-52页 |
| 3.1 海洋生物溶菌酶基因片段扩增分析 | 第37-38页 |
| 3.1.1 太平洋牡蛎总RNA的质量检测 | 第37-38页 |
| 3.1.2 RT-PCR扩增CgLys基因 | 第38页 |
| 3.2 海洋生物溶菌酶基因的亚克隆 | 第38-43页 |
| 3.2.1 CgLys重组克隆质粒的构建 | 第38-39页 |
| 3.2.2 阳性转化子菌落PCR的鉴定 | 第39-40页 |
| 3.2.3 阳性转化子的双酶切鉴定 | 第40-41页 |
| 3.2.4 pMD18-T-CgLys测序鉴定 | 第41-43页 |
| 3.3 构建重组表达质粒pPIC9K-CgLys和pPICgK-SjLys | 第43-45页 |
| 3.3.1 双酶切pMD18-T-CgLys、pMD18-T-SjLy及pPIC9K | 第43-44页 |
| 3.3.2 构建海生物溶菌酶重组表达质粒 | 第44-45页 |
| 3.3.2.1 构建表达质粒pPICgK-CgLys和pPICgK-SjLys | 第44页 |
| 3.3.2.2 重组海洋生物溶菌酶表达质粒菌落PCR检测 | 第44-45页 |
| 3.3.2.3 重组海洋生物溶菌酶表达质粒测序鉴定 | 第45页 |
| 3.4 海洋生物溶菌酶基因工程菌的构建 | 第45-52页 |
| 3.4.1 重组表达质粒的线性化 | 第45-47页 |
| 3.4.2 毕赤酵母的电转化 | 第47-48页 |
| 3.4.3 筛选具有溶菌酶活性的基因工程菌 | 第48-50页 |
| 3.4.4 重组海洋生物溶菌酶的SDS-PAGE检测 | 第50-52页 |
| 第四章 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 致谢 | 第57页 |
