| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 目录 | 第11-16页 |
| 插图和附表清单(先图后表) | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-34页 |
| 1.1 三七的化学成分 | 第18-21页 |
| 1.1.1 皂苷 | 第18-20页 |
| 1.1.2 甾醇 | 第20页 |
| 1.1.3 氨基酸 | 第20页 |
| 1.1.4 其他成分 | 第20-21页 |
| 1.1.4.1 人参炔三醇 | 第20页 |
| 1.1.4.2 黄酮类 | 第20-21页 |
| 1.1.4.3 糖类 | 第21页 |
| 1.1.4.4 无机元素 | 第21页 |
| 1.2 三七的药理学研究进展 | 第21-23页 |
| 1.2.1 对心脑血管系统的影响 | 第21-23页 |
| 1.2.1.1 抗心律失常 | 第22页 |
| 1.2.1.2 防止动脉粥样硬化 | 第22页 |
| 1.2.1.3 降血压 | 第22页 |
| 1.2.1.4 抗休克 | 第22-23页 |
| 1.2.2 抗癌作用 | 第23页 |
| 1.2.3 对免疫系统的影响 | 第23页 |
| 1.2.4 降血脂 | 第23页 |
| 1.3 三七皂苷的生物合成 | 第23-27页 |
| 1.3.1 三七皂苷生物合成途径 | 第23-25页 |
| 1.3.2 三七皂苷生物合成途径中的关键酶 | 第25-27页 |
| 1.3.2.1 鲨烯合酶 | 第25-26页 |
| 1.3.2.2 鲨烯环氧酶 | 第26页 |
| 1.3.2.3 氧化鲨烯环化酶 | 第26-27页 |
| 1.4 植物中RNA干扰技术研究概况 | 第27-31页 |
| 1.4.1 RNA干扰作用的发现和作用机制 | 第27-29页 |
| 1.4.2 RNAi在植物研究中的应用 | 第29-30页 |
| 1.4.2.1 RNAi与植物次级代谢工程 | 第29页 |
| 1.4.2.2 RNAi与植物抗病 | 第29页 |
| 1.4.2.3 RNAi与植物雄性不育 | 第29-30页 |
| 1.4.3 植物中RNAi载体的构建方法 | 第30-31页 |
| 1.4.3.1 传统的酶切-连接技术 | 第30页 |
| 1.4.3.2 重组PCR技术与酶切-连接相结合 | 第30-31页 |
| 1.4.3.3 利用同源重组进行RNAi载体的构建 | 第31页 |
| 1.5 本研究的目的、意义及存在的问题 | 第31-33页 |
| 1.6 本实验技术路线 | 第33-34页 |
| 第二章 三七中CAS基因RNAi表达载体的构建 | 第34-49页 |
| 2.1 前言 | 第34页 |
| 2.2 材料和试剂 | 第34-36页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第34页 |
| 2.2.2 菌株和载体 | 第34-35页 |
| 2.2.3 试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.4 缓冲液和培养基 | 第36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-42页 |
| 2.3.1 三七总RNA的提取以及纯化 | 第36-38页 |
| 2.3.2 RNAi片段的合成 | 第38-39页 |
| 2.3.2.1 cDNA合成 | 第38页 |
| 2.3.2.2 RNAi片段的扩增 | 第38-39页 |
| 2.3.2.3 确定扩增片段的准确性 | 第39页 |
| 2.3.3 连有attB重组位点的RNAi片段的克隆 | 第39-41页 |
| 2.3.3.1 SDS碱裂解法进行质粒抽提 | 第39-40页 |
| 2.3.3.2 连有attB重组位点的RNAi片段的克隆 | 第40页 |
| 2.3.3.3 PCR产物胶回收 | 第40-41页 |
| 2.3.4 CAS基因RNAi表达载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.3.4.1 RNAi表达载体的构建 | 第41页 |
| 2.3.4.2 RNAi表达载体的分子检测 | 第41-42页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第42-46页 |
| 2.4.1 三七总RNA提取 | 第42页 |
| 2.4.2 RNAi片段的扩增及含attB重组位点的RNAi片段的获得 | 第42-44页 |
| 2.4.3 RNAi表达载体的构建及其分子检测 | 第44-46页 |
| 2.5 讨论 | 第46-49页 |
| 2.5.1 RNAi载体构建的注意事项 | 第46-47页 |
| 2.5.2 影响RNA干扰效率的因素 | 第47-49页 |
| 第三章 根癌农杆菌介导的遗传转化及转基因细胞的筛选 | 第49-68页 |
| 3.1 前言 | 第49页 |
| 3.2 材料和试剂 | 第49-51页 |
| 3.2.1 植物材料 | 第49页 |
| 3.2.2 菌种 | 第49页 |
| 3.2.3 试剂 | 第49-50页 |
| 3.2.4 缓冲液和培养基 | 第50-51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-55页 |
| 3.3.1 SDS碱裂解法提取质粒 | 第51页 |
| 3.3.2 制备根癌农杆菌感受态 | 第51页 |
| 3.3.3 RNAi表达载体pHellsgate-CAS转化农杆菌感受态细胞 | 第51-52页 |
| 3.3.4 RNAi表达载体转化农杆菌的菌液PCR鉴定 | 第52页 |
| 3.3.5 农杆菌介导的三七遗传转化 | 第52-53页 |
| 3.3.5.1 农杆菌的活化 | 第52页 |
| 3.3.5.2 农杆菌介导的遗传转化 | 第52-53页 |
| 3.3.6 转基因三七细胞系的分子检测 | 第53-55页 |
| 3.3.6.1 阳性转基因细胞系的普通PCR检测 | 第53-54页 |
| 3.3.6.2 三七愈伤组织不同生长阶段与皂苷合成相关基因表达量分析 | 第54页 |
| 3.3.6.3 阳性转基因细胞荧光定量PCR检测 | 第54-55页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第55-66页 |
| 3.4.1 农杆菌转化子的鉴定 | 第55-56页 |
| 3.4.2 转基因三七细胞系的分子检测 | 第56-66页 |
| 3.4.2.1 转基因三七细胞系的普通PCR检测 | 第57-58页 |
| 3.4.2.2 三七愈伤组织不同生长阶段与皂苷合成相关基因表达量分析 | 第58-59页 |
| 3.4.2.3 转基因细胞系的荧光定量PCR检测 | 第59-66页 |
| 3.5 讨论 | 第66-68页 |
| 3.5.1 实验材料选用三七愈伤组织的原因 | 第66页 |
| 3.5.2 遗传转化过程中农杆菌的抑制 | 第66-67页 |
| 3.5.3 乙酰丁香酮在根癌农杆菌介导的遗传转化中的作用 | 第67页 |
| 3.5.4 荧光定量PCR注意事项 | 第67-68页 |
| 第四章 转基因三七细胞次级代谢物含量测定 | 第68-81页 |
| 4.1 前言 | 第68页 |
| 4.2 材料和试剂 | 第68页 |
| 4.2.1 植物材料 | 第68页 |
| 4.2.2 试剂 | 第68页 |
| 4.3 实验方法 | 第68-73页 |
| 4.3.1 三七愈伤组织中总皂苷含量检测 | 第68-70页 |
| 4.3.1.1 标准曲线的制备 | 第68-69页 |
| 4.3.1.2 三七愈伤组织中总皂苷含量的测定 | 第69-70页 |
| 4.3.2 三七愈伤组织中单体皂苷含量的测定 | 第70-71页 |
| 4.3.3 三七愈伤组织中植物总甾醇含量的测定 | 第71-73页 |
| 4.4 实验结果和分析 | 第73-79页 |
| 4.4.1 三七愈伤组织中总皂苷含量的测定 | 第73-75页 |
| 4.4.2 三七愈伤组织中单体皂苷含量的测定 | 第75-77页 |
| 4.4.3 三七愈伤组织中植物甾醇含量的测定 | 第77-79页 |
| 4.5 讨论 | 第79-81页 |
| 4.5.1 三七单体皂昔的提取 | 第79页 |
| 4.5.2 CAS基因沉默对三七次级代谢物的影响 | 第79-81页 |
| 第五章 结论和展望 | 第81-83页 |
| 5.1 结论 | 第81-82页 |
| 5.2 展望 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-96页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表文章目录 | 第96页 |
