| 符号说明 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 一、文献综述 | 第13-24页 |
| 摘要 | 第13页 |
| 1 精子和卵细胞的成熟 | 第13-14页 |
| 2 精子穿透卵丘细胞层和透明带 | 第14页 |
| 3 精子与卵细胞膜的相互作用 | 第14-24页 |
| 3.1 参与精-卵膜相互作用的精子蛋白 | 第15-20页 |
| 3.1.1 IZUMO蛋白家族 | 第15-17页 |
| 3.1.2 ADAM蛋白家族 | 第17-19页 |
| 3.1.3 CRISP蛋白家族 | 第19-20页 |
| 3.1.4 精子上的SLLP1,SAMP14,和SAMP32 | 第20页 |
| 3.2 参与精-卵膜相互作用的卵子蛋白 | 第20-24页 |
| 3.2.1 卵上的CD9蛋白 | 第20-21页 |
| 3.2.2 卵上的其它四旋蛋白 | 第21-22页 |
| 3.2.3 卵上的GPI锚定蛋白 | 第22页 |
| 3.2.4 卵上的整合素 | 第22-23页 |
| 3.2.5 叶酸受体4-Juno | 第23-24页 |
| 二、绵羊Izumo2 cDNA的克隆与序列分析 | 第24-46页 |
| 前言 | 第24-26页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-27页 |
| 2.1.1 实验动物组织 | 第26页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第26页 |
| 2.1.3 试剂与材料 | 第26页 |
| 2.1.4 常用试剂配方 | 第26-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-35页 |
| 2.2.1 绵羊睾丸组织总RNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.2 cDNA的合成与检测 | 第27-28页 |
| 2.2.3 绵羊Izumo2 cDNA的克隆 | 第28-34页 |
| 2.2.3.1 绵羊Izumo2 cDNA第一段的克隆 | 第28-32页 |
| 2.2.3.1.1 绵羊Izumo2 cDNA第一段的PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.3.1.2 目的片段与pMD19-T Vector的连接 | 第29-30页 |
| 2.2.3.1.3 CaCl_2法制备E.coli DH5a感受态细胞 | 第30页 |
| 2.2.3.1.4 转化E.coli DH5α感受态菌 | 第30页 |
| 2.2.3.1.5 鉴定 | 第30-32页 |
| 2.2.3.2 绵羊Izumo2 cDNA第二段的克隆 | 第32-33页 |
| 2.2.3.3 绵羊Izumo2 cDNA全长的克隆 | 第33-34页 |
| 2.2.4 绵羊Izumo2 cDNA序列与蛋白结构分析 | 第34-35页 |
| 2.3 结果 | 第35-44页 |
| 2.3.1 绵羊睾丸组织总RNA的提取与鉴定 | 第35页 |
| 2.3.2 绵羊cDNA的检测 | 第35页 |
| 2.3.3 绵羊Izumo2 cDNA第一段的克隆与鉴定 | 第35-36页 |
| 2.3.4 绵羊Izumo2 cDNA第二段的克隆与鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.5 绵羊Izumo2 cDNA全长的克隆与鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.6 绵羊Izumo2 cDNA序列与蛋白结构分析 | 第38-44页 |
| 2.3.6.1 绵羊Izumo2 cDNA第一段测序结果 | 第38-39页 |
| 2.3.6.2 绵羊Izumo2 cDNA第二段测序结果 | 第39页 |
| 2.3.6.3 绵羊Izumo2 cDNA全长测序结果 | 第39-41页 |
| 2.3.6.4 绵羊Izumo2 cDNA序列比对 | 第41-42页 |
| 2.3.6.5 绵羊IZUMO2氨基酸序列比对 | 第42页 |
| 2.3.6.6 绵羊IZUMO2蛋白结构分析 | 第42-44页 |
| 2.4 讨论 | 第44-46页 |
| 三、绵羊Izumo2原核表达载体的构建与重组蛋白的分离纯化 | 第46-60页 |
| 前言 | 第46-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第47-49页 |
| 3.1.1 菌种及质粒 | 第47页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第47页 |
| 3.1.3 试剂与材料 | 第47页 |
| 3.1.4 常用试剂配方 | 第47-49页 |
| 3.2 实验方法 | 第49-54页 |
| 3.2.1 绵羊Izumo2原核表达载体pGEX-Izumo2的引物设计与合成 | 第49页 |
| 3.2.2 绵羊pGEX-Izumo2原核表达载体的构建 | 第49-51页 |
| 3.2.2.1 PCR扩增目的片段 | 第49-50页 |
| 3.2.2.3 过度载体pMD-Izumo2的构建 | 第50页 |
| 3.2.2.4 原核表达载体pGEX-Izumo2的构建 | 第50-51页 |
| 3.2.3 绵羊IZUMO2在大肠杆菌中的表达 | 第51页 |
| 3.2.4 SDS-PAGE电泳鉴定GST-IZUMO2融合蛋白 | 第51页 |
| 3.2.5 Western blotting鉴定GST-IZUMO2融合蛋白 | 第51-52页 |
| 3.2.6 GST-IZUMO2融合蛋白的纯化 | 第52-53页 |
| 3.2.7 考马斯亮蓝法测定GST-IZUMO2融合蛋白的浓度 | 第53-54页 |
| 3.3 结果 | 第54-58页 |
| 3.3.1 目的片段的PCR扩增与鉴定 | 第54页 |
| 3.3.2 过度载体pMD-Izumo2的构建与鉴定 | 第54-55页 |
| 3.3.3 原核表达载体pGEX-Izumo2的构建与鉴定 | 第55页 |
| 3.3.4 绵羊IZUMO2在大肠杆菌中的融合表达与蛋白纯化 | 第55-56页 |
| 3.3.5 GST-IZUMO2融合蛋白的Western blotting鉴定 | 第56-57页 |
| 3.3.6 蛋白浓度测定 | 第57-58页 |
| 3.4 讨论 | 第58-60页 |
| 四、小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体的制备 | 第60-69页 |
| 前言 | 第60-61页 |
| 4.1 实验材料 | 第61-62页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第61页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第61页 |
| 4.1.3 试剂与材料 | 第61页 |
| 4.1.4 实验细胞 | 第61-62页 |
| 4.2 实验方法 | 第62-66页 |
| 4.2.1 小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体的制备 | 第62-63页 |
| 4.2.1.1 培养腹水瘤细胞 | 第62页 |
| 4.2.1.2 免疫小鼠 | 第62-63页 |
| 4.2.2 小鼠抗绵羊GST-IZUMO2腹水多克隆抗体的纯化 | 第63页 |
| 4.2.3 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的特异性检测 | 第63-64页 |
| 4.2.4 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的效价测定 | 第64-66页 |
| 4.3 结果 | 第66-68页 |
| 4.3.1 小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体的纯化 | 第66页 |
| 4.3.2 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的特异性检测 | 第66-67页 |
| 4.3.3 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的效价测定 | 第67-68页 |
| 4.4 讨论 | 第68-69页 |
| 五、绵羊IZUMO2在睾丸及精子中的定位检测 | 第69-76页 |
| 前言 | 第69-70页 |
| 5.1 实验材料 | 第70-71页 |
| 5.1.1 实验动物 | 第70页 |
| 5.1.2 实验仪器 | 第70页 |
| 5.1.3 试剂与材料 | 第70页 |
| 5.1.4 常用试剂配方 | 第70-71页 |
| 5.2 实验方法 | 第71-73页 |
| 5.2.1 绵羊IZUMO2蛋白在睾丸组织中的定位检测 | 第71-72页 |
| 5.2.1.1 绵羊睾丸组织石蜡切片的制作 | 第71页 |
| 5.2.1.2 免疫组织化学染色 | 第71-72页 |
| 5.2.2 绵羊IZUMO2蛋白在顶体反应前后精子中的定位检测 | 第72-73页 |
| 5.2.2.1 绵羊精子的采集 | 第72页 |
| 5.2.2.2 免疫组织化学染色 | 第72-73页 |
| 5.3 结果 | 第73-75页 |
| 5.3.1 绵羊IZUMO2蛋白在睾丸组织中的定位 | 第73页 |
| 5.3.2 绵羊IZUMO2蛋白在顶体反应前后精子中的定位 | 第73-75页 |
| 5.4 讨论 | 第75-76页 |
| 六、绵羊IZUMO2与其它精卵融合相关蛋白相互作用的初步研究 | 第76-91页 |
| 前言 | 第76-78页 |
| 6.1 实验材料 | 第78-80页 |
| 6.1.1 菌种及质粒 | 第78页 |
| 6.1.2 实验仪器 | 第78页 |
| 6.1.3 试剂与材料 | 第78页 |
| 6.1.4 常用试剂配方 | 第78-80页 |
| 6.2 实验方法 | 第80-84页 |
| 6.2.1 酵母载体pGAD-Izumo2、pGBK-Izumo2的引物设计与合成 | 第80页 |
| 6.2.2 酵母载体pGAD-Izumo2、pGBK-Izumo2的构建 | 第80页 |
| 6.2.3 酵母双杂交法检验蛋白相互作用 | 第80-84页 |
| 6.2.3.1 酵母感受态的制备 | 第80-81页 |
| 6.2.3.2 酵母感受态的转化 | 第81页 |
| 6.2.3.3 PCR鉴定 | 第81页 |
| 6.2.3.4 诱饵蛋白在Y2H Glod中的毒性检测与自激活检测 | 第81-82页 |
| 6.2.3.5 酵母Y2H Gold与酵母Y187的杂交 | 第82-83页 |
| 6.2.3.6 酵母双杂交方法检验IZUMO2与IZUMO1的相互作用 | 第83页 |
| 6.2.3.7 阳性对照与阴性对照 | 第83-84页 |
| 6.3 结果 | 第84-89页 |
| 6.3.1 目的片段的PCR扩增与鉴定 | 第84页 |
| 6.3.2 过度载体pMD-Izumo2-AD和pMD-Izumo2-BK的构建与鉴定 | 第84-85页 |
| 6.3.3 酵母载体pGAD-Izumo2、pGBK-Izumo2的构建与鉴定 | 第85页 |
| 6.3.4 PCR鉴定 | 第85-86页 |
| 6.3.5 杂交结合体的鉴定 | 第86-87页 |
| 6.3.6 酵母缺陷平板生长结果 | 第87-89页 |
| 6.4 讨论 | 第89-91页 |
| 参考文献 | 第91-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文 | 第96页 |
