| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 引言 | 第13-17页 |
| 1 水产养殖现状 | 第13页 |
| 2 溶菌酶的简介及作用原理 | 第13-14页 |
| 3 溶菌酶的研究现状 | 第14-15页 |
| 4 毕赤酵母表达系统 | 第15-16页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第16-17页 |
| 第一章 斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）天然C型溶菌酶成熟肽基因在毕赤酵母中的表达 | 第17-41页 |
| 1.1 材料 | 第17-20页 |
| 1.1.1 基因与菌株 | 第17页 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器设备 | 第17-18页 |
| 1.1.3 主要试剂配制 | 第18-20页 |
| 1.2 方法 | 第20-31页 |
| 1.2.1 引物设计 | 第20-21页 |
| 1.2.2 目的基因的cflyc的PCR扩增 | 第21-25页 |
| 1.2.2.1 第一次PCR扩增 | 第21-24页 |
| 1.2.2.2 第二次PCR扩增 | 第24页 |
| 1.2.2.3 第三次PCR扩增 | 第24-25页 |
| 1.2.3 重组表达载体的构建 | 第25-27页 |
| 1.2.3.1 空载体pPICZαA的双酶切 | 第25页 |
| 1.2.3.2 pMD19-T-cflyc的双酶切 | 第25-26页 |
| 1.2.3.3 连接转化 | 第26页 |
| 1.2.3.4 重组表达载体pPICZαA-cflyc的鉴定 | 第26-27页 |
| 1.2.4 重组载体pPICZαA-cflyc电转化毕赤酵母X-33 | 第27-29页 |
| 1.2.4.1 重组载体pPICZαA-cflyc的线性化 | 第27页 |
| 1.2.4.2 重组载体pPICZαA-cflyc的电转化 | 第27-29页 |
| 1.2.5 目的蛋白cflyc的表达及其活性分析 | 第29-31页 |
| 1.2.5.1 cflyc的诱导表达及鉴定 | 第29-30页 |
| 1.2.5.2 cflyc的分时段表达 | 第30页 |
| 1.2.5.3 cflyc的分离纯化与质谱鉴定 | 第30-31页 |
| 1.2.5.4 cflyc的抑菌活性分析 | 第31页 |
| 1.3 结果 | 第31-39页 |
| 1.3.1 目的基因的扩增结果 | 第31-33页 |
| 1.3.2 重组表达载体pPICZαA-cflyc的验证 | 第33-34页 |
| 1.3.3 阳性酵母转化子的筛选 | 第34-35页 |
| 1.3.4 目的蛋白的表达及Western blot鉴定 | 第35-36页 |
| 1.3.5 不同时段目的蛋白的表达分析 | 第36页 |
| 1.3.6 目的蛋白cflyc的纯化及鉴定 | 第36-39页 |
| 1.3.7 表达产物的抑菌活性 | 第39页 |
| 1.4 讨论 | 第39-41页 |
| 第二章 斑点叉尾鮰C型溶菌酶基因在毕赤酵母中的密码子及表达条件的优化 | 第41-54页 |
| 2.1 材料 | 第41-42页 |
| 2.1.1 实验质粒与菌株 | 第41页 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 | 第41页 |
| 2.1.3 主要试剂配制 | 第41-42页 |
| 2.2 方法 | 第42-45页 |
| 2.2.1 目的基因ocflyc的优化合成 | 第42页 |
| 2.2.2 真核表达载体pPICZαA-ocflyc的构建 | 第42-43页 |
| 2.2.3 酵母转化子的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.4 目的蛋白ocflyc的表达分析 | 第44-45页 |
| 2.2.4.1 ocflyc的试表达及Western blot分析 | 第44页 |
| 2.2.4.2 不同诱导时间下ocflyc的表达量 | 第44页 |
| 2.2.4.3 不同甲醇浓度诱导下ocflyc的表达量 | 第44页 |
| 2.2.4.4 不同培养基下ocflyc的表达分析 | 第44页 |
| 2.2.4.5 pH值对发酵产物ocflyc的影响 | 第44页 |
| 2.2.4.6 ocflyc的纯化鉴定 | 第44-45页 |
| 2.3 结果 | 第45-52页 |
| 2.3.1 目的基因ocflyc优化后的设计扩增 | 第45-46页 |
| 2.3.2 重组表达载体pPICZαA-ocflyc的鉴定 | 第46页 |
| 2.3.3 阳性酵母转化子的PCR鉴定 | 第46-47页 |
| 2.3.4 目的蛋白ocflyc在毕赤酵母中的试表达 | 第47-48页 |
| 2.3.5 不同表达条件对发酵产物的影响 | 第48-51页 |
| 2.3.5.1 不同表达时间对目的蛋白表达量的影响 | 第48-49页 |
| 2.3.5.2 不同浓度的甲醇对目的蛋白表达量的影响 | 第49-50页 |
| 2.3.5.3 不同培养基对目的蛋白表达量的影响 | 第50页 |
| 2.3.5.4 pH值对目的蛋白的影响 | 第50-51页 |
| 2.3.6 目的蛋白ocflyc的纯化及质谱鉴定 | 第51-52页 |
| 2.4 讨论 | 第52-54页 |
| 第三章 斑点叉尾鮰C型溶菌酶基因优化设计后对其抑菌活性的影响 | 第54-65页 |
| 3.1 材料 | 第54页 |
| 3.1.1 主要质粒与菌株 | 第54页 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 | 第54页 |
| 3.2 方法 | 第54-57页 |
| 3.2.1 hocflyc和wocflyc基因的PCR扩增 | 第54-56页 |
| 3.2.2 重组表达载体pPICZαA-hocflyc与pPICZαA-wocflyc的构建 | 第56页 |
| 3.2.3 重组载体电转入毕赤酵母 | 第56页 |
| 3.2.4 目的蛋白hocflyc和wocflyc在毕赤酵母中的表达及活性分析 | 第56-57页 |
| 3.2.5 不同培养基下wocflyc的表达 | 第57页 |
| 3.2.6 不同的培养温度对发酵产物wocflyc的影响 | 第57页 |
| 3.3 结果 | 第57-64页 |
| 3.3.1 目的基因hocflyc和wocflyc的获取 | 第57-58页 |
| 3.3.2 重组表达载体pPICZαA-hocflyc与pPICZαA-wocflyc的鉴定 | 第58-59页 |
| 3.3.3 PCR鉴定酵母转化子 | 第59-60页 |
| 3.3.4 目的蛋白的表达及其抑菌活性 | 第60-62页 |
| 3.3.6 培养基的pH值对发酵产物wocflyc的影响 | 第62页 |
| 3.3.7 低温对发酵产物wocflyc活性的影响 | 第62-64页 |
| 3.4 讨论 | 第64-65页 |
| 第四章 结论与展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
