| 名词缩写 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 综述 | 第12-17页 |
| 1 恶臭假单胞菌KT2440 | 第12-13页 |
| 1.1 概述 | 第12页 |
| 1.2 研究进展 | 第12-13页 |
| 2 谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 | 第13-14页 |
| 2.1 概述 | 第13页 |
| 2.2 研究进展 | 第13-14页 |
| 3 重组 | 第14页 |
| 3.1 基因重组 | 第14页 |
| 3.2 同源重组 | 第14页 |
| 4 重组工程 | 第14-16页 |
| 4.1 重组工程机理 | 第15页 |
| 4.2 重组工程研究进展 | 第15-16页 |
| 5 定点突变 | 第16-17页 |
| 第二章 重组工程和Cre/loxP介导的恶臭假单胞菌KT2440无标记基因敲除 | 第17-46页 |
| 第一节 双质粒系统对P.putida KT2440染色体基因的无标记敲除 | 第17-31页 |
| 1 实验材料 | 第17-21页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第17-19页 |
| 1.2 引物及测序 | 第19-20页 |
| 1.3 主要培养基及溶液的配制 | 第20-21页 |
| 1.4 主要工具酶及各种化学试剂 | 第21页 |
| 1.5 主要实验仪器设备 | 第21页 |
| 2 实验方法 | 第21-26页 |
| 2.1 常规分子生物学操作方法 | 第21-24页 |
| 2.2 P.putida KT2440原株及含重组酶诱导表达的P.putida KT2440菌株电转感受态细胞的制备及DNA的电转化 | 第24页 |
| 2.3 Cre/loxP介导的双质粒系统无标记基因敲除方法 | 第24-26页 |
| 2.4 含sacB基因的质粒消除方法 | 第26页 |
| 3 实验结果 | 第26-31页 |
| 3.1 pLS2352对PP_3948的敲除 | 第26-27页 |
| 3.2 pLS2352和pLS1678双质粒系统对PP_0589的敲除 | 第27-28页 |
| 3.3 pLS2352和pLS1678双质粒系统对PP_1384—PP_1388的敲除 | 第28-29页 |
| 3.4 pLS2352和pLS1678双质粒系统对PP_2064—PP_2069的敲除 | 第29-30页 |
| 3.5 pLS2352和pLS1678双质粒系统对PP_0075——PP_0077的敲除 | 第30-31页 |
| 4 分析与讨论 | 第31页 |
| 第二节 两种单质粒Cre/loxP重组系统对P.putida KT2440染色体基因的敲除 | 第31-36页 |
| 1 实验材料 | 第32页 |
| 1.1 主要培养基及溶液的配制 | 第32页 |
| 1.2 主要工具酶及各种化学试剂 | 第32页 |
| 1.3 主要实验仪器设备及来源 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-35页 |
| 2.1 常规分子生物学操作方法 | 第32页 |
| 2.2 含重组酶诱导表达体系的P.putida KT2440菌株电转感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 2.3 Cre/loxP介导的单质粒系统无标记基因敲除方法 | 第32页 |
| 2.4 含sacB基因的质粒消除方法 | 第32页 |
| 2.5 单个Cre/loxP重组质粒的构建 | 第32-35页 |
| 3 实验结果 | 第35-36页 |
| 3.1 tetR-ptetA-cre基因盒和重组酶表达基因盒整合为单质粒pLS3048对PP_0589的敲除 | 第35页 |
| 3.2 araC-pBAD-cre基因盒和重组酶表达基因盒整合为单质粒pLS3061对PP_0589的敲除 | 第35-36页 |
| 4 分析与讨论 | 第36页 |
| 第三节 一种mekR-PmekA单质粒诱导表达的Cre/loxP重组系统对P.putidaKT2440染色体基因的敲除 | 第36-42页 |
| 1 实验材料 | 第36页 |
| 1.1 主要培养基及溶液的配制 | 第36页 |
| 1.2 主要工具酶及各种化学试剂 | 第36页 |
| 1.3 主要实验仪器设备及来源 | 第36页 |
| 2 实验方法 | 第36-38页 |
| 2.1 常规分子生物学操作方法 | 第36-37页 |
| 2.2 mekR-pmekA-cre基因盒和重组酶表达基因盒整合为单质粒pLS3063的构建 | 第37页 |
| 2.3 含重组酶诱导表达体系的P.putida KT2440菌株电转感受态细胞的制备 | 第37-38页 |
| 3 实验结果 | 第38-42页 |
| 3.1 pLS3063单质粒系统对PP_0589基因敲除 | 第38-39页 |
| 3.2 pLS3063单质粒系统对PP_1384—PP_1388基因敲除 | 第39-40页 |
| 3.3 pLS3063单质粒系统对PP_2064—PP_2069基因敲除 | 第40-41页 |
| 3.4 pLS3063单质粒系统对PP_0075—PP_0077基因敲除 | 第41-42页 |
| 4 分析与讨论 | 第42页 |
| 第四节 Cre/lox66-lox71系统介导的P.putida KT2440染色体基因的敲除 | 第42-46页 |
| 1 实验材料 | 第43页 |
| 1.1 主要培养基及溶液的配制 | 第43页 |
| 1.2 主要工具酶及各种化学试剂 | 第43页 |
| 1.3 主要实验仪器设备及来源 | 第43页 |
| 2 实验方法 | 第43页 |
| 2.1 常规分子生物学操作方法 | 第43页 |
| 2.2 含诱导重组酶表达体系的P.putida KT2440菌株电转感受态细胞的制备 | 第43页 |
| 2.3 Cre/lox66-lox71介导的单质粒系统无标记基因敲除方法 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-44页 |
| 3.1 P.putida KT2440/pLS2352和pLS1678双质粒系统利用Cre/lox66-lox71对四种基因的敲除 | 第43-44页 |
| 3.2 P.putida KT2440/pLS3063单质粒系统利用Cre/lox66-lox71对四种基因的敲除 | 第44页 |
| 4 分析与讨论 | 第44-46页 |
| 第三章 重组工程法敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032染色体基因 | 第46-67页 |
| 第一节 redαβ和recET两种重组系统质粒的构建及对谷氨酸棒状杆菌基因敲除的效率比较 | 第46-57页 |
| 1 实验材料 | 第46-50页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第46-47页 |
| 1.2 引物的合成及测序 | 第47-49页 |
| 1.3 主要培养基及溶液的配制 | 第49-50页 |
| 1.4 主要工具酶及各种化学试剂 | 第50页 |
| 1.5 主要实验仪器设备及来源 | 第50页 |
| 2 实验方法 | 第50-55页 |
| 2.1 常规分子生物学操作方法 | 第50页 |
| 2.2 C.glutamicum ATCC 13032及含有重组酶表达载体的C.glutamicumATCC 13032电转感受态细胞制备 | 第50-51页 |
| 2.3 重组工程介导的C.glutamicum ATCC13032基因敲除原理 | 第51页 |
| 2.4 含有recET或redαβ重组酶基因质粒的构建 | 第51-55页 |
| 3 实验结果 | 第55-57页 |
| 3.1 两种重组质粒对C glutamicum ATCC 13032中crtI2基因的敲除 | 第55页 |
| 3.2 两种重组质粒对C glutamicum ATCC 13032中upp基因的敲除 | 第55-56页 |
| 3.3 两种重组系统基因敲除效率的比较 | 第56-57页 |
| 3.4 利用两种系统敲除neo抗性基因 | 第57页 |
| 第二节 recET系统敲除大片段基因及点突变实验 | 第57-61页 |
| 1 实验材料 | 第57页 |
| 2 实验方法 | 第57-58页 |
| 2.1 分子生物学基本实验方法 | 第57-58页 |
| 2.2 点突变的基本原理原理 | 第58页 |
| 3 实验结果 | 第58-60页 |
| 3.1 recET重组系统对大片段cgp3基因的敲除 | 第58-59页 |
| 3.2 recET重组系统介导的fasR基因点突变 | 第59-60页 |
| 4 分析与讨论 | 第60-61页 |
| 第三节 消除neo抗性基因的不同诱导质粒的构建 | 第61-67页 |
| 1 实验材料 | 第61页 |
| 2 实验方法 | 第61-65页 |
| 2.1 分子生物学基本实验方法 | 第61页 |
| 2.2 不同质粒的构建 | 第61-65页 |
| 3 实验结果 | 第65-66页 |
| 4 分析与讨论 | 第66-67页 |
| 总结 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 科研成果 | 第76页 |
