| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 前言 | 第8-14页 |
| 实验材料和方法 | 第14-31页 |
| 一、实验材料 | 第14-16页 |
| 1. 主要仪器 | 第14-15页 |
| 2. 主要试剂 | 第15页 |
| 3. 菌毒株,载体质粒,细胞和实验动物 | 第15-16页 |
| 二.实验方法 | 第16-31页 |
| 1. 构建pETP6重组质粒并鉴定 | 第16-21页 |
| ·合成引物 | 第16-17页 |
| ·TB-Chen株RV VP6全编码基因组的PCR扩增 | 第17页 |
| ·回收PCR扩增产物 | 第17页 |
| ·制备连接片段并进行连接和转化 | 第17-19页 |
| ·连接片段的制备 | 第17-18页 |
| ·VP6基因与pETL载体酶切片断连接 | 第18页 |
| ·连接反应产物转化DH5α感受态细胞 | 第18-19页 |
| ·重组表达质粒pETP6的制备及鉴定 | 第19-21页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒DNA | 第19页 |
| ·Nde Ⅰ/BamH Ⅰ酶切鉴定重组表达质粒 | 第19页 |
| ·大量制备质粒DNA | 第19-20页 |
| ·核苷酸序列测定 | 第20-21页 |
| 2 pETP6v载体质粒的构建及鉴定 | 第21-24页 |
| ·携带Sac Ⅱ酶切位点的载体质粒制备及鉴定 | 第21-24页 |
| ·携带Sac Ⅱ酶切位点的插入片段的制备 | 第21-22页 |
| ·载体片段制备 | 第22页 |
| ·插入片段与载体质粒酶切片段的连接 | 第22-23页 |
| ·连接反应产物转化DH5α大肠杆菌细胞 | 第23页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒DNA | 第23页 |
| ·酶切鉴定重组表达质粒pETP6v(Sac Ⅱ) | 第23页 |
| ·大量制备质粒DNA | 第23页 |
| ·核苷酸序列测定 | 第23-24页 |
| 3. 含有VP6蛋白基因不同位置上带有不同酶切位点的pETP6v载体质粒的构建 | 第24页 |
| 4. 携带RV VP4抗原表位重组表达质粒pETP6F298S/P[8]296和pETP6F298S/P[8]381的构建及鉴定 | 第24-26页 |
| ·外源抗原表位(P[8]296,P[8]381)的设计 | 第24-25页 |
| ·引物互补片段的制备 | 第25页 |
| ·载体质粒pETP6F酶切片段的制备 | 第25页 |
| ·插入片段和载体质粒pETP6v酶切片段的连接及转化 | 第25-26页 |
| ·连接反应产物转化DH5α大肠杆菌细胞 | 第26页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒DNA | 第26页 |
| ·酶切鉴定重组表达质粒 | 第26页 |
| ·大量制备质粒DNA | 第26页 |
| ·核苷酸序列测定 | 第26页 |
| 5. 重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白6F/P[8]296,6F/P[8]381在大肠杆菌中的表达 | 第26-27页 |
| 6. 重组载体蛋白(rVP6v)和重组嵌合蛋白的纯化 | 第27页 |
| 7. Bradford法测定纯化蛋白的浓度 | 第27-28页 |
| 8. MA104细胞复苏与传代培养 | 第28页 |
| ·MA104细胞的复苏 | 第28页 |
| ·MA104细胞的传代培养 | 第28页 |
| 9. RV增殖,收获 | 第28-29页 |
| 10. RV的纯化 | 第29页 |
| 11. 动物免疫及血清抗体的制备 | 第29-30页 |
| ·实验动物分组 | 第29页 |
| ·免疫方案 | 第29-30页 |
| 12. 微量滴定法测Wa病毒感染性滴度 | 第30页 |
| 13. 重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白pETP6F298S/P[8]/296和pETP6F298S/P[8]/381免疫豚鼠血清中和抗体效价的检测 | 第30页 |
| 14. Western blot检测纯化的重组嵌合蛋白的免疫原性 | 第30-31页 |
| 结果与分析 | 第31-38页 |
| 1 质粒的构建 | 第31-33页 |
| ·VP6基因的扩增 | 第31-32页 |
| ·携带RV VP6基因的重组表达质粒pETP6的构建及鉴定 | 第32页 |
| ·携带外源抗原表位的重组表达质粒pETP6F298S/P[8]/296和pETP6F298S/P[8]/381的构建及鉴定 | 第32-33页 |
| 2 重组嵌合蛋白在BL21(DE3)中的表达和纯化 | 第33-34页 |
| 3 纯化蛋白浓度的测定 | 第34-35页 |
| 4 RV病毒感染性滴度的测定和免疫动物血清中和抗体滴度测定 | 第35-36页 |
| 5 Western blot分析 | 第36-38页 |
| 讨论 | 第38-41页 |
| 小结 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-46页 |
| 附录 | 第46-65页 |
| (一) 缩略词 | 第46-47页 |
| (二) 主要溶液配方 | 第47-55页 |
| (三) 主要实验步骤 | 第55-63页 |
| (四) RVTB-CHEN株VP6编码基因核苷酸序列及氨基酸序列 | 第63-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 研究生简历 | 第66-68页 |
