| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-18页 |
| ·国内外研究现状 | 第10-11页 |
| ·睡眠肽 | 第11-13页 |
| ·人血清白蛋白 | 第13-14页 |
| ·穿导肽 | 第14-15页 |
| ·连接肽 | 第15-16页 |
| ·蛋白类药物长效性的研究概况 | 第16页 |
| ·毕赤酵母 | 第16-17页 |
| ·研究的目的及意义 | 第17-18页 |
| 第二章 pPIC9K/PTDHSALinkerDSIP 重组质粒的构建 | 第18-34页 |
| ·实验材料 | 第18-20页 |
| ·菌种与质粒 | 第18页 |
| ·培养基 | 第18页 |
| ·工具酶 | 第18-19页 |
| ·其他试剂 | 第19页 |
| ·缓冲液 | 第19页 |
| ·主要仪器 | 第19-20页 |
| ·实验方法 | 第20-27页 |
| ·pPIC9K/PTDHSALinkerDSIP 重组质粒的构建 | 第20-21页 |
| ·pPIC9K/HSA 质粒的抽提 | 第21页 |
| ·PHLD 基因片段的获得及其 PCR 引物的设计 | 第21页 |
| ·PHLD 基因的扩增 | 第21-22页 |
| ·琼脂糖凝胶回收 PHLD 基因片段 | 第22页 |
| ·T 基因加 A 反应 | 第22-23页 |
| ·加 A 的 PHLD 基因与 T载体的连接 | 第23页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第23页 |
| ·连接液的转化 | 第23-24页 |
| ·蓝白筛选 | 第24页 |
| ·阳性克隆的验证 | 第24-25页 |
| ·pPIC9K 载体和 pUCmT/PHLD 基因的酶切 | 第25页 |
| ·pPIC9K 载体大片段和 PHLD 基因酶切片段的连接 | 第25-26页 |
| ·转化子的 PCR 验证和酶切验证 | 第26页 |
| ·阳性克隆的测序 | 第26-27页 |
| ·结果与分析 | 第27-33页 |
| ·目的基因的扩增 | 第27页 |
| ·PHLD 重组子的克隆构建 | 第27-30页 |
| ·阳性克隆的测序 | 第30-33页 |
| ·讨论 | 第33-34页 |
| 第三章 重组 pPIC9K/PHLD 毕赤酵母工程菌的构建及高表达工程菌株的筛选 | 第34-44页 |
| ·试剂与仪器 | 第34-36页 |
| ·菌株 | 第34页 |
| ·培养基 | 第34-35页 |
| ·工具酶 | 第35页 |
| ·蛋白质分子量 Markers | 第35页 |
| ·其他试剂 | 第35页 |
| ·缓冲液 | 第35-36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-40页 |
| ·pPIC9K/PHLD 重组质粒的线性化 | 第36-37页 |
| ·线性化质粒的回收 | 第37-38页 |
| ·毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备 | 第38页 |
| ·毕赤酵母 GSll5 感受态细胞的转化 | 第38页 |
| ·his+阳性克隆表型筛选 | 第38页 |
| ·G418 筛选高拷贝转化子 | 第38-39页 |
| ·高表达重组 pPIC9K/PHD(PHLD)毕赤酵母工程菌的筛选 | 第39页 |
| ·重组 pPIC9K/ PHLD 毕赤酵母工程菌蛋白表达的 SDSPAGE 分析 | 第39-40页 |
| ·结果与分析 | 第40-43页 |
| ·阳性重组酵母克隆的筛选及表型鉴定 | 第40-41页 |
| ·G418 筛选高拷贝工程菌株 | 第41-42页 |
| ·摇瓶筛选结果 | 第42-43页 |
| ·讨论 | 第43-44页 |
| 第四章 PHLD 融合蛋白的制备及活性的初评 | 第44-51页 |
| ·实验材料 | 第44-45页 |
| ·菌株 | 第44页 |
| ·动物 | 第44页 |
| ·各种试剂 | 第44页 |
| ·主要试剂的配制 | 第44-45页 |
| ·主要仪器 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-46页 |
| ·lut1211 菌株最佳诱导时间的确定 | 第45页 |
| ·lut1211 菌株发酵周期及表达谱的测定 | 第45页 |
| ·融合蛋白的初步分离纯化 | 第45-46页 |
| ·PHLD 融合蛋白对戊巴比妥钠催眠作用的影响 | 第46页 |
| ·统计学方法 | 第46页 |
| ·结果与分析 | 第46-49页 |
| ·lut1211 菌株最佳诱导时间的确定 | 第46-47页 |
| ·lut1211 菌株发酵周期及表达谱的测定 | 第47-48页 |
| ·融合蛋白的初步分离纯化 | 第48页 |
| ·PHLD 融合蛋白对戊巴比妥钠催眠作用的影响 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49-51页 |
| 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 附录 A （攻读硕士学位期间所发表的论文及成果） | 第57-58页 |
| 附录 B（PHLD 测序结果） | 第58-60页 |
