| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 缩略语表 | 第9-11页 |
| 目录 | 第11-19页 |
| 第一章 草木樨状黄芪与霸王不对称体细胞杂交的研究 | 第19-77页 |
| 第一节 文献综述 | 第19-35页 |
| 1.体细胞融合技术的发展 | 第20-22页 |
| 2.体细胞融合方式的研究进展 | 第22-23页 |
| 3.杂种细胞的筛选 | 第23-24页 |
| 4.体细胞杂种的鉴定 | 第24-27页 |
| ·RFLP和RAPD应用于鉴定体细胞杂种 | 第24-25页 |
| ·种特异重复DNA | 第25页 |
| ·Southern杂交在体细胞杂交中的运用 | 第25-26页 |
| ·基因组原位杂交在植物杂种中的鉴定 | 第26页 |
| ·其它方法 | 第26-27页 |
| 5.本实验研究背景、目的及意义 | 第27页 |
| 参考文献 | 第27-35页 |
| 第二节 草木樨状黄芪原生质体培养及再生植株 | 第35-43页 |
| 1 材料和方法 | 第35-36页 |
| ·植物材料 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-36页 |
| ·预处理方式 | 第35页 |
| ·原生质体的分离及纯化 | 第35-36页 |
| ·原生质体的培养 | 第36页 |
| ·愈伤组织的形成及植株分化 | 第36页 |
| 2.实验结果与分析 | 第36-43页 |
| ·原生质体的游离 | 第36-38页 |
| ·不同预处理对分离原生质体的影响 | 第36-37页 |
| ·预处理对原生质体活力的影响 | 第37-38页 |
| ·原生质体的早期分裂及其影响因素 | 第38-43页 |
| ·原生质体培养与早期分裂 | 第38页 |
| ·原生质体培养浓度和细胞分裂素浓度对原生质体分裂频率的影响 | 第38-40页 |
| ·愈伤组织的形成与不同激素组合对苗分化的影响 | 第40-43页 |
| 第三节 霸王的原生质体培养 | 第43-49页 |
| 1 材料与方法 | 第43-44页 |
| ·植物材料 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-44页 |
| ·预处理 | 第43页 |
| ·原生质体的游离及纯化 | 第43-44页 |
| ·原生质体的培养 | 第44页 |
| ·愈伤组织的形成及植株分化 | 第44页 |
| 2 实验结果与分析 | 第44-49页 |
| ·原生质体的游离与纯化 | 第44-45页 |
| ·影响原生质体分裂频率的因素 | 第45-48页 |
| ·原生质体再生愈伤组织的分化 | 第48-49页 |
| 第四节 草木樨状黄芪与霸王科间体细胞杂交 | 第49-67页 |
| 1 材料与方法 | 第49-56页 |
| ·材料来源 | 第49页 |
| ·融合方法 | 第49-51页 |
| ·罗丹明(R-6G)处理受体原生质体 | 第49-50页 |
| ·紫外线(UV-C)处理核供体原生质体 | 第50页 |
| ·融合诱导液的配制 | 第50页 |
| ·原生质体融合方法与步骤 | 第50-51页 |
| ·杂种细胞的培养及愈伤组织的形成 | 第51页 |
| ·杂种愈伤组织的分化 | 第51页 |
| ·杂种愈伤组织的检测 | 第51-56页 |
| ·杂种愈伤组织的细胞学观察 | 第51页 |
| ·杂种愈伤组织的RAPD分析 | 第51-52页 |
| ·杂种愈伤组织的线粒体CAPS(or PCR-RFLP)分析 | 第52页 |
| ·杂种愈伤组织可溶性蛋白的PAGE检测 | 第52-54页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOS-PAGE)试剂 | 第52-54页 |
| ·蛋白提取溶液 | 第54页 |
| ·杂种愈伤组织对渗透胁迫的反应 | 第54页 |
| ·PEG对杂种愈伤组织内的游离脯氨酸含量的影响 | 第54-56页 |
| ·试剂 | 第55页 |
| ·操作步骤 | 第55-56页 |
| ·脯氨酸标准曲线制作 | 第55页 |
| ·样品制定 | 第55-56页 |
| ·结果计算 | 第56页 |
| 2 结果与讨论 | 第56-67页 |
| ·不同浓度的罗丹明-6G对受体原生质体的植板率的影响 | 第56-57页 |
| ·紫外线照射对供体原生质体植板率的影响 | 第57页 |
| ·两种融合方法对融合频率的影响 | 第57-58页 |
| ·杂种愈伤组织分化 | 第58页 |
| ·杂种愈伤组织的染色体检测 | 第58-59页 |
| ·杂种愈伤组织的分子检测 | 第59-60页 |
| ·杂种愈伤组织的RAPD分析 | 第59页 |
| ·杂种愈伤组织的线粒体CAPS(or PCR-RFLP)分析 | 第59-60页 |
| ·杂种愈伤组织的SDS-PAGE分析 | 第60-61页 |
| ·杂种及其亲本愈伤组织对盐胁迫的抵抗能力分析 | 第61-62页 |
| ·杂种愈伤组织的抗旱性分析 | 第62-67页 |
| ·杂种愈伤组织的耐盐性分析 | 第62-63页 |
| ·杂种及其双亲的抗旱性分析 | 第63-67页 |
| 第五节 讨论 | 第67-74页 |
| 1.亲本原生质体的分裂及其影响因素 | 第67-69页 |
| 2.杂种的鉴别和筛选 | 第69-70页 |
| 3.杂种愈伤组织的细胞学及分子特征 | 第70-71页 |
| 4.杂种愈伤组织的抗性分析 | 第71-72页 |
| 5.杂种未能再生完整植株的可能原因 | 第72-73页 |
| 6.结论 | 第73页 |
| 7.本研究的创新点 | 第73页 |
| 8.本研究有待进一步开展的工作 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-77页 |
| 第二章 PA1基因的克隆及其对苜蓿的转化 | 第77-120页 |
| 第一节 前言 | 第77-86页 |
| 1 抗植物虫害的基因种类及其抗虫原理 | 第77-79页 |
| ·抗植物虫害的基因种类 | 第77页 |
| ·抗植物虫害基因的抗虫原理 | 第77-79页 |
| ·Bt基因的抗虫原理 | 第78页 |
| ·蛋白酶抑制剂基因的抗虫原理 | 第78页 |
| ·植物凝集素的抗虫原理 | 第78-79页 |
| 2 抗虫基因的克隆及改造 | 第79-81页 |
| ·抗虫基因的克隆 | 第79页 |
| ·抗虫基因的改造 | 第79-81页 |
| ·对非必需区段进行缺失处理 | 第80页 |
| ·基因改造 | 第80页 |
| ·利用定位信号提高基因表达 | 第80页 |
| ·利用基质结合区提高基因表达 | 第80页 |
| ·叶绿体转化 | 第80-81页 |
| ·改进Ti质粒转化载体的启动子 | 第81页 |
| 3 PA1蛋白及其基因 | 第81-82页 |
| 4 国内外对苜蓿的研究现状 | 第82-85页 |
| ·苜蓿的品质改良 | 第83-84页 |
| ·苜蓿抗虫性研究 | 第84-85页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第85-86页 |
| 第二节 食荚大菜豌种子储藏蛋白基因PA1表达载体的构建 | 第86-99页 |
| 1 实验材料 | 第86-87页 |
| ·植物材料 | 第86页 |
| ·载体、菌株与抗生素 | 第86页 |
| ·试剂 | 第86-87页 |
| ·酶及试剂盒 | 第86页 |
| ·DNA提取所用溶液 | 第86页 |
| ·大肠杆菌和根癌农杆菌质粒提取的试剂 | 第86-87页 |
| ·培养基 | 第87页 |
| 2 实验方法 | 第87-94页 |
| ·总DNA的提取 | 第87页 |
| ·PCR方法分离PA1基因片段 | 第87-89页 |
| ·引物设计 | 第87页 |
| ·PCR扩增 | 第87-88页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第88-89页 |
| ·大肠杆菌转化和转化子鉴定 | 第89-91页 |
| ·连接 | 第89页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第89-90页 |
| ·转化E. coli DH5α | 第90页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第90-91页 |
| ·大肠杆菌转化子PCR鉴定 | 第91页 |
| ·大肠杆菌转化子酶切鉴定 | 第91页 |
| ·DNA序列测定和分析 | 第91页 |
| ·PA1基因表达载体的构建 | 第91-92页 |
| ·根癌农杆菌转化和转化子鉴定 | 第92-94页 |
| ·PA1表达载体pCAMBIA-PA1质粒的提取及纯化 | 第92页 |
| ·根癌农杆菌LBA4404感受态的制备 | 第92-93页 |
| ·转化 | 第93页 |
| ·根癌农杆菌质粒的提取 | 第93-94页 |
| ·质粒的PCR检测 | 第94页 |
| ·根癌农杆菌转化子的双酶切鉴定 | 第94页 |
| 3 结果与分析 | 第94-99页 |
| ·目的基因的克隆 | 第94-95页 |
| ·食荚大菜豆PA1基因的部分序列的测定及分析 | 第95-96页 |
| ·豌豆PA1基因同源片段的序列分析 | 第96页 |
| ·植物PA1表达载体的构建、PCR检测和酶切 | 第96-99页 |
| 第三节 农杆菌介导的PA1基因对苜蓿的遗传转化 | 第99-120页 |
| 1 材料与方法 | 第99-109页 |
| ·材料 | 第99-102页 |
| ·植物材料 | 第99页 |
| ·菌种 | 第99页 |
| ·PCR扩增引物 | 第99页 |
| ·所用培养基及试剂的配制 | 第99-102页 |
| ·受体植物体胚发生及诱导培养基 | 第99页 |
| ·根癌农杆菌LBA4404的培养基 | 第99-100页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第100页 |
| ·主要试剂配制 | 第100-102页 |
| ·实验方法 | 第102-109页 |
| ·植物受体材料的准备 | 第102页 |
| ·受体植物胚性愈伤组织的诱导及再生 | 第102-103页 |
| ·再生苗的扦插扩繁 | 第103页 |
| ·紫花苜蓿对潮霉素的抗性分析 | 第103页 |
| ·根癌农杆菌介导的苜蓿胚状体再生途径转化体系的建立 | 第103-104页 |
| ·农杆菌菌株的培养 | 第103页 |
| ·苜蓿下胚轴和子叶转化及抗卡那霉素再生植株筛选 | 第103-104页 |
| ·苜蓿转基因再生植株的分子检测 | 第104-108页 |
| ·CTAB微量提取法提取苜蓿转基因植株总DNA | 第104页 |
| ·PCR扩增反应检测 | 第104-105页 |
| ·转基因苜蓿的Southern印记分析 | 第105-108页 |
| ·转基因苜蓿叶片的SDS-PAGE | 第108页 |
| ·转基因苜蓿的细胞学观察 | 第108-109页 |
| ·转基因苜蓿的气孔密度及气孔中叶绿体 | 第108页 |
| ·紫花苜蓿转化系的根尖染色体观察 | 第108-109页 |
| 2 结果分析 | 第109-115页 |
| ·紫花苜蓿胚状体再生频率 | 第109页 |
| ·苜蓿愈伤组织及植株对潮霉素的抗性 | 第109-110页 |
| ·苜蓿外植体的转化和筛选 | 第110-111页 |
| ·转基因紫花苜蓿再生植株的PCR检测 | 第111-112页 |
| ·转基因紫花苜蓿再生植株的Sorthorn blotting检测 | 第112-113页 |
| ·转基因苜蓿再生植株SDS-PAGE分析 | 第113-114页 |
| ·转基因苜蓿的细胞学分 | 第114-115页 |
| ·转基因苜蓿叶片下表皮气孔密度与叶绿体分析 | 第114页 |
| ·紫花苜蓿转基因的染色体分析 | 第114-115页 |
| 3 讨论 | 第115-119页 |
| ·PA1基因在大食荚菜豌中的克隆与特征分析 | 第115-116页 |
| ·PA1基因对苜蓿的转化和表达 | 第116-119页 |
| ·影响LBA4404转化苜蓿的因素 | 第116-117页 |
| ·转化系体细胞胚的变异 | 第117-118页 |
| ·PA1基因的表达 | 第118-119页 |
| 4.结论 | 第119-120页 |
| ·从食荚大菜豌中克隆出AP1基因,并构建了PA1的植物表达载体pCAMBIA1301PA1 | 第119-120页 |
| ·获得携带目的基因的重组根癌农杆菌LBA4404 | 第120页 |
| ·获得整合有PA1基因的转基因紫花苜蓿再生植株 | 第120页 |
| 5 本研究创新点 | 第120页 |
| 6 本研究有待进一步开展的工作 | 第120页 |
| 参考文献 | 第120-133页 |
| 攻读博士学位期间研究成果和奖励 | 第133-134页 |
| 致谢 | 第134页 |
