| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4页 |
| 前言 | 第8-10页 |
| 第1章 文献概述 | 第10-24页 |
| 1.1 木质素的概述 | 第10-14页 |
| 1.1.1 木质素的组成,结构以及形成 | 第10-13页 |
| 1.1.2 木质素的分类 | 第13页 |
| 1.1.3 木质素的开发的意义 | 第13-14页 |
| 1.2 木质素的研究进展 | 第14-22页 |
| 1.2.1 木质素的物理化学催化降解 | 第14-16页 |
| 1.2.2 木质素的生物催化降解 | 第16-22页 |
| 1.3 酿酒酵母作为工程菌的应用 | 第22-23页 |
| 1.3.1 酿酒酵母作为工程菌的优势 | 第22页 |
| 1.3.2 酿酒酵母分泌表达的类型以及手段 | 第22-23页 |
| 1.4 本研究的工作内容 | 第23-24页 |
| 第2章 实验材料和方法 | 第24-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-31页 |
| 2.1.1 试验用菌株 | 第24-25页 |
| 2.1.2 实验用质粒和引物 | 第25-28页 |
| 2.1.3 培养基的配置 | 第28-29页 |
| 2.1.4 实验试剂 | 第29-31页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-36页 |
| 2.2.1 目的片段的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.2 酶切与连接反应 | 第32-33页 |
| 2.2.3 连接产物转化大肠杆菌 | 第33页 |
| 2.2.4 阳性转化子的筛选和验证以及测序 | 第33页 |
| 2.2.5 酵母转化 | 第33-34页 |
| 2.2.6 酵母基因组提取 | 第34页 |
| 2.2.7 酵母菌落PCR方法 | 第34-35页 |
| 2.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳样品的制备 | 第35页 |
| 2.2.9 配置2块15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶 | 第35-36页 |
| 2.2.10 上样电泳 | 第36页 |
| 2.3 酶活测定 | 第36-37页 |
| 2.3.1 粗酶液的提取 | 第36页 |
| 2.3.2 蛋白质含量的测定 | 第36-37页 |
| 2.3.3 ligD粗酶活性测定 | 第37页 |
| 2.4 细胞培养 | 第37-38页 |
| 2.5 产物UV-HPLC检测 | 第38-40页 |
| 第3章 胞内表达选择性的断裂木质素Β-O-4键的木质素酶 | 第40-50页 |
| 3.1 胞内表达木质素酶基因 | 第40-44页 |
| 3.1.1 木质素酶基因的选择 | 第40-42页 |
| 3.1.2 木质素酶基因表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 3.1.3 构建完成质粒转化得到的菌株 | 第43页 |
| 3.1.4 胞内表达对木质素模式底物降解效果的影响 | 第43-44页 |
| 3.2 反应条件的优化 | 第44-49页 |
| 3.2.1 最优底物浓度的确定 | 第44-45页 |
| 3.2.2 缓冲液组成对酶解的影响 | 第45-46页 |
| 3.2.3 温度对酶解的影响 | 第46-47页 |
| 3.2.4 pH对酶解的影响 | 第47-48页 |
| 3.2.5 金属离子对酶解的影响 | 第48-49页 |
| 3.3 本章小结 | 第49-50页 |
| 第4章 分泌表达影响木质素酶酶活 | 第50-78页 |
| 4.1 分泌表达木质素酶 | 第51-62页 |
| 4.1.1 信号肽的选择和启动子的选择 | 第51-52页 |
| 4.1.2 分泌表达载体的模型设计验证 | 第52-53页 |
| 4.1.3 分泌表达木质素酶基因载体构建 | 第53-54页 |
| 4.1.4 构建完成的质粒转化得到的菌株 | 第54页 |
| 4.1.5 分泌表达对酵母生长的影响 | 第54-55页 |
| 4.1.6 信号肽分泌表达对模式底物降解的影响 | 第55-60页 |
| 4.1.7 不同的初始接种比例对模式底物降解的影响 | 第60-62页 |
| 4.2 培养基中直接添加底物 | 第62-66页 |
| 4.2.1 敲除ALD6基因 | 第62-64页 |
| 4.2.2 缓冲液调节溶液pH | 第64-66页 |
| 4.3 不同启动子强度表达木质素酶基因 | 第66-70页 |
| 4.3.1 启动子的选择 | 第66-67页 |
| 4.3.2 质粒的构建 | 第67页 |
| 4.3.3 构建完成的质粒转化得到的菌株 | 第67-68页 |
| 4.3.4 不同启动子强度对模式底物降解的影响 | 第68-69页 |
| 4.3.5 优化组成型表达和Gal1p诱导的初始细胞接种比例 | 第69-70页 |
| 4.4 酵母分泌条件优化 | 第70-74页 |
| 4.4.1 培养基对酶解的影响 | 第71-72页 |
| 4.4.2 培养温度的优化 | 第72-73页 |
| 4.4.3 糖浓度对酿酒酵母酶分泌的影响 | 第73-74页 |
| 4.5 表面展示和分泌表达 | 第74-76页 |
| 4.5.1 表面展示和分泌表达的表达盒的设计 | 第74-75页 |
| 4.5.2 构建得到的菌株 | 第75页 |
| 4.5.3 表面展示和分泌表达对菌株生长的影响 | 第75-76页 |
| 4.5.4 表面展示和分泌表达对酶解的影响 | 第76页 |
| 4.6 本章小结 | 第76-78页 |
| 第5章 结论与展望 | 第78-80页 |
| 5.1 总结 | 第78-79页 |
| 5.2 展望 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-92页 |
| 附录 | 第92-102页 |
| 发表论文和参加参加科研情况说明 | 第102-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
