摘要 | 第10-11页 |
Abstract | 第11-12页 |
1 前言 | 第13-19页 |
1.1 奶牛乳腺泌乳信号转导通路 | 第13-14页 |
1.1.1 奶牛乳腺乳合成的基本过程 | 第13页 |
1.1.2 调控乳蛋白和乳脂肪合成的主要信号转导通路 | 第13-14页 |
1.2 氨酰tRNA合成酶的功能研究 | 第14-15页 |
1.2.1 氨酰tRNA合成酶的结构与功能 | 第14-15页 |
1.2.2 甘氨酰tRNA合成酶的研究进展 | 第15页 |
1.3 METTL3基因的功能研究 | 第15-16页 |
1.3.1 METTL3的基本结构与功能 | 第15-16页 |
1.3.2 METTL3基因功能的研究进展 | 第16页 |
1.4 NFκB基因的功能研究 | 第16-17页 |
1.4.1 NFκB的基本结构与功能 | 第16页 |
1.4.2 NFκB基因功能的研究进展 | 第16-17页 |
1.5 细胞自噬及其调节 | 第17-18页 |
1.5.1 细胞自噬概述 | 第17页 |
1.5.2 调节细胞自噬的信号通路 | 第17-18页 |
1.6 蛋白激酶的分类和分子结构特征 | 第18页 |
1.7 实验目的与意义 | 第18-19页 |
2 材料与方法 | 第19-36页 |
2.1 实验材料 | 第19-22页 |
2.1.1 主要实验试剂 | 第19-20页 |
2.1.2 主要实验仪器 | 第20页 |
2.1.3 实验动物与细胞 | 第20页 |
2.1.4 主要试剂的配制 | 第20-22页 |
2.2 BMECs的培养、纯化与鉴定 | 第22-25页 |
2.2.1 BMECs的原代培养与纯化 | 第22页 |
2.2.2 BMECs的鉴定 | 第22-24页 |
2.2.3 BMECs的冻存与复苏 | 第24-25页 |
2.3 GlyRS基因表达对BMECs自噬的影响 | 第25-29页 |
2.3.1 pCMV-C-EGFP-LC3B真核表达载体构建 | 第25-28页 |
2.3.2 抑制GlyRS的表达对BMECs自噬的影响 | 第28-29页 |
2.4 GlyRS介导蛋氨酸对BMECs自噬的调节 | 第29-30页 |
2.5 NFκB1基因的抑制和过表达对BMECs自噬的影响 | 第30页 |
2.5.1 NFκB1基因抑制对BMECs自噬的影响 | 第30页 |
2.5.2 NFκB1基因过表达对BMECs自噬的影响 | 第30页 |
2.6 抑制METTL3的表达对BMECs自噬的影响 | 第30页 |
2.7 p-GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第30-33页 |
2.7.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-GlyRS与METTL3的相互作用 | 第30-31页 |
2.7.2 METTL3的原核表达及蛋白纯化 | 第31-32页 |
2.7.3 GlyRS的原核表达及蛋白纯化 | 第32页 |
2.7.4 GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第32-33页 |
2.7.5 p-GlyRS激活METTL3的激酶反应 | 第33页 |
2.8 胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第33-36页 |
2.8.1 转染pCMV-C-Flag-GlyRS重组质粒至BMECs | 第33-34页 |
2.8.2 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定 | 第34页 |
2.8.3 Flag纯化试剂盒结合磷酸化试剂盒纯化pCMV-C-Flag-GlyRS | 第34-35页 |
2.8.4 纯化后的胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第35-36页 |
3 结果与分析 | 第36-53页 |
3.1 BMECs的原代培养、纯化及鉴定 | 第36-38页 |
3.1.1 免疫荧光染色法鉴定BMECs | 第36-37页 |
3.1.2 蛋白质免疫印迹(WB)法检测BMECs | 第37-38页 |
3.2 GlyRS基因表达对BMECs自噬的影响 | 第38-40页 |
3.2.1 pCMV-C-EGFP-LC3B真核表达载体构建 | 第38-39页 |
3.2.2 抑制GlyRS的表达对BMECs自噬的影响 | 第39-40页 |
3.3 GlyRS介导蛋氨酸对BMECs自噬的调节 | 第40-42页 |
3.3.1 Westernblot检测GlyRS介导蛋氨酸对BMECs的自噬调节 | 第40-41页 |
3.3.2 免疫荧光染色法检测GlyRS介导蛋氨酸对BMECs自噬的调节 | 第41-42页 |
3.4 NFκB1基因的过表达和抑制对BMECs自噬的影响 | 第42-45页 |
3.4.1 过表达NFκB1对BMECs自噬的影响 | 第42-43页 |
3.4.2 抑制NFκB1的表达对BMECs自噬的影响 | 第43-45页 |
3.5 抑制METTL3的表达对BMECs自噬的影响 | 第45-46页 |
3.6 p-GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第46-50页 |
3.6.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-GlyRS与METTL3的相互作用 | 第46页 |
3.6.2 METTL3的原核表达及蛋白纯化 | 第46-48页 |
3.6.3 GlyRS的原核表达及蛋白纯化 | 第48页 |
3.6.4 GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第48-49页 |
3.6.5 p-GlyRS激活METTL3的激酶反应 | 第49-50页 |
3.7 胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第50-53页 |
3.7.1 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定 | 第50-51页 |
3.7.2 Flag纯化试剂盒结合磷酸化试剂盒纯化pCMV-C-Flag-GlyRS | 第51-52页 |
3.7.3 纯化后的胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应 | 第52-53页 |
4 讨论 | 第53-57页 |
4.1 BMECs的原代培养、纯化及鉴定 | 第53页 |
4.2 GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3对牛乳腺上皮细胞自噬的调控作用 | 第53-54页 |
4.2.1 GlyRS对BMECs自噬的调控作用 | 第53-54页 |
4.2.2 NFκB1对BMECs自噬的调控作用 | 第54页 |
4.2.3 METTL3对BMECs自噬的调控作用 | 第54页 |
4.3 p-GlyRS对METTL3的激活作用 | 第54-55页 |
4.4 GlyRS可能作为蛋白激酶的结构推测 | 第55页 |
4.5 METTL3磷酸化位点预测 | 第55-57页 |
5 结论 | 第57-58页 |
致谢 | 第58-59页 |
参考文献 | 第59-67页 |
附录 | 第67-69页 |
攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第69页 |