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GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3对牛乳腺上皮细胞自噬的调控作用

摘要第10-11页
Abstract第11-12页
1 前言第13-19页
    1.1 奶牛乳腺泌乳信号转导通路第13-14页
        1.1.1 奶牛乳腺乳合成的基本过程第13页
        1.1.2 调控乳蛋白和乳脂肪合成的主要信号转导通路第13-14页
    1.2 氨酰tRNA合成酶的功能研究第14-15页
        1.2.1 氨酰tRNA合成酶的结构与功能第14-15页
        1.2.2 甘氨酰tRNA合成酶的研究进展第15页
    1.3 METTL3基因的功能研究第15-16页
        1.3.1 METTL3的基本结构与功能第15-16页
        1.3.2 METTL3基因功能的研究进展第16页
    1.4 NFκB基因的功能研究第16-17页
        1.4.1 NFκB的基本结构与功能第16页
        1.4.2 NFκB基因功能的研究进展第16-17页
    1.5 细胞自噬及其调节第17-18页
        1.5.1 细胞自噬概述第17页
        1.5.2 调节细胞自噬的信号通路第17-18页
    1.6 蛋白激酶的分类和分子结构特征第18页
    1.7 实验目的与意义第18-19页
2 材料与方法第19-36页
    2.1 实验材料第19-22页
        2.1.1 主要实验试剂第19-20页
        2.1.2 主要实验仪器第20页
        2.1.3 实验动物与细胞第20页
        2.1.4 主要试剂的配制第20-22页
    2.2 BMECs的培养、纯化与鉴定第22-25页
        2.2.1 BMECs的原代培养与纯化第22页
        2.2.2 BMECs的鉴定第22-24页
        2.2.3 BMECs的冻存与复苏第24-25页
    2.3 GlyRS基因表达对BMECs自噬的影响第25-29页
        2.3.1 pCMV-C-EGFP-LC3B真核表达载体构建第25-28页
        2.3.2 抑制GlyRS的表达对BMECs自噬的影响第28-29页
    2.4 GlyRS介导蛋氨酸对BMECs自噬的调节第29-30页
    2.5 NFκB1基因的抑制和过表达对BMECs自噬的影响第30页
        2.5.1 NFκB1基因抑制对BMECs自噬的影响第30页
        2.5.2 NFκB1基因过表达对BMECs自噬的影响第30页
    2.6 抑制METTL3的表达对BMECs自噬的影响第30页
    2.7 p-GlyRS作用于METTL3的激酶反应第30-33页
        2.7.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-GlyRS与METTL3的相互作用第30-31页
        2.7.2 METTL3的原核表达及蛋白纯化第31-32页
        2.7.3 GlyRS的原核表达及蛋白纯化第32页
        2.7.4 GlyRS作用于METTL3的激酶反应第32-33页
        2.7.5 p-GlyRS激活METTL3的激酶反应第33页
    2.8 胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应第33-36页
        2.8.1 转染pCMV-C-Flag-GlyRS重组质粒至BMECs第33-34页
        2.8.2 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定第34页
        2.8.3 Flag纯化试剂盒结合磷酸化试剂盒纯化pCMV-C-Flag-GlyRS第34-35页
        2.8.4 纯化后的胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应第35-36页
3 结果与分析第36-53页
    3.1 BMECs的原代培养、纯化及鉴定第36-38页
        3.1.1 免疫荧光染色法鉴定BMECs第36-37页
        3.1.2 蛋白质免疫印迹(WB)法检测BMECs第37-38页
    3.2 GlyRS基因表达对BMECs自噬的影响第38-40页
        3.2.1 pCMV-C-EGFP-LC3B真核表达载体构建第38-39页
        3.2.2 抑制GlyRS的表达对BMECs自噬的影响第39-40页
    3.3 GlyRS介导蛋氨酸对BMECs自噬的调节第40-42页
        3.3.1 Westernblot检测GlyRS介导蛋氨酸对BMECs的自噬调节第40-41页
        3.3.2 免疫荧光染色法检测GlyRS介导蛋氨酸对BMECs自噬的调节第41-42页
    3.4 NFκB1基因的过表达和抑制对BMECs自噬的影响第42-45页
        3.4.1 过表达NFκB1对BMECs自噬的影响第42-43页
        3.4.2 抑制NFκB1的表达对BMECs自噬的影响第43-45页
    3.5 抑制METTL3的表达对BMECs自噬的影响第45-46页
    3.6 p-GlyRS作用于METTL3的激酶反应第46-50页
        3.6.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-GlyRS与METTL3的相互作用第46页
        3.6.2 METTL3的原核表达及蛋白纯化第46-48页
        3.6.3 GlyRS的原核表达及蛋白纯化第48页
        3.6.4 GlyRS作用于METTL3的激酶反应第48-49页
        3.6.5 p-GlyRS激活METTL3的激酶反应第49-50页
    3.7 胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应第50-53页
        3.7.1 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定第50-51页
        3.7.2 Flag纯化试剂盒结合磷酸化试剂盒纯化pCMV-C-Flag-GlyRS第51-52页
        3.7.3 纯化后的胞核GlyRS作用于METTL3的激酶反应第52-53页
4 讨论第53-57页
    4.1 BMECs的原代培养、纯化及鉴定第53页
    4.2 GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3对牛乳腺上皮细胞自噬的调控作用第53-54页
        4.2.1 GlyRS对BMECs自噬的调控作用第53-54页
        4.2.2 NFκB1对BMECs自噬的调控作用第54页
        4.2.3 METTL3对BMECs自噬的调控作用第54页
    4.3 p-GlyRS对METTL3的激活作用第54-55页
    4.4 GlyRS可能作为蛋白激酶的结构推测第55页
    4.5 METTL3磷酸化位点预测第55-57页
5 结论第57-58页
致谢第58-59页
参考文献第59-67页
附录第67-69页
攻读硕士学位期间发表的学术论文第69页

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