| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第19-31页 |
| 1.1 T7转录系统 | 第19-23页 |
| 1.1.1 T7转录系统简介 | 第19-20页 |
| 1.1.2 T7转录系统在原核生物中的应用 | 第20-21页 |
| 1.1.3 T7转录系统在真核生物中的应用 | 第21-22页 |
| 1.1.4 T7转录系统在合成生物学中的研究进展 | 第22-23页 |
| 1.2 酿酒酵母异源表达 | 第23-25页 |
| 1.2.1 酿酒酵母简介 | 第23-24页 |
| 1.2.2 酿酒酵母表达系统 | 第24-25页 |
| 1.3 HIV-1 Rev-RRE元件 | 第25-29页 |
| 1.3.1 HIV-1病毒 | 第25-26页 |
| 1.3.2 HIV-1 Rev-RRE元件的结构与功能 | 第26-27页 |
| 1.3.3 Rev-RRE作用机制及其应用 | 第27-29页 |
| 1.4 甘露糖异构酶(Mannose isomerase,Fmi)简介 | 第29页 |
| 1.5 主要研究内容 | 第29-30页 |
| 1.6 本课题的研究意义 | 第30-31页 |
| 第二章 T7转录系统在酿酒酵母中的初步构建 | 第31-53页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第31-34页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.2 仪器设备 | 第32-33页 |
| 2.2.3 生化试剂与试剂盒 | 第33页 |
| 2.2.4 培养基及其配方 | 第33-34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-39页 |
| 2.3.1 与载体构建相关的分子生物学实验操作 | 第34-35页 |
| 2.3.2 酿酒酵母感受态的制备及转化 | 第35页 |
| 2.3.3 酿酒酵母基因组提取及实时荧光定量 | 第35-36页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE蛋白电泳和western blot蛋白印迹 | 第36-37页 |
| 2.3.4.1 蛋白的提取与浓度测定 | 第36-37页 |
| 2.3.4.2 T7 RNAP蛋白的检测 | 第37页 |
| 2.3.5 荧光显微镜检测绿色荧光蛋白EGFP表达 | 第37页 |
| 2.3.6 共聚焦显微镜观察T7 RNAP核定位 | 第37-38页 |
| 2.3.7 质粒构建示意图 | 第38-39页 |
| 2.3.7.1 整合型质粒pMRI-P_(CYC1)-T7RNAP和pMRI-P_(CYC1-204)-T7RNAP的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.7.2 游离型质粒pUG-P_(T7)-EGFP-T_(T7)的构建 | 第39页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第39-50页 |
| 2.4.1 整合型质粒pMRI-P_(CYC1)-T7RNAP的构建 | 第39-41页 |
| 2.4.2 游离型质粒pUG-P_(T7)-EGFP-T_(T7)的构建 | 第41-43页 |
| 2.4.3 T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)核定位的验证 | 第43-44页 |
| 2.4.4 T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)表达检测 | 第44-48页 |
| 2.4.5 绿色荧光蛋白EGFP的检测 | 第48-50页 |
| 2.5 本章小结 | 第50-53页 |
| 第三章 Rev-RRE元件在酿酒酵母中功能验证的研究 | 第53-69页 |
| 3.1 引言 | 第53页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第53-55页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第53-54页 |
| 3.2.2 试剂与仪器 | 第54-55页 |
| 3.3 实验方法 | 第55-57页 |
| 3.3.1 与载体构建相关的分子生物学实验操作 | 第55页 |
| 3.3.2 载体构建流程 | 第55-57页 |
| 3.3.2.1 质粒pESC-P_(gal)-Rev-EGFP-T_(CYC1)和pESC-P_(gal)-NLS-Rev-EGFP-T_(CYC1)的构建 | 第55页 |
| 3.3.2.2 整合型质粒pMRI-Rev的构建 | 第55-56页 |
| 3.3.2.3 验证Rev蛋白结合RRE序列的相关载体构建 | 第56-57页 |
| 3.3.3 共聚焦显微镜观察Rev蛋白核定位 | 第57页 |
| 3.3.4 多功能酶标仪检测酿酒酵母平均荧光强度 | 第57页 |
| 3.3.5 甘露糖异构酶Fmi酶活的测定 | 第57页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第57-67页 |
| 3.4.1 整合型质粒pMRI-Rev的构建 | 第57-58页 |
| 3.4.2 游离型质粒pESC-P_(gal)-Rev-EGFP-T_(CYC1)和pESC-P_(gal)-NLS-Rev-EGFP-T_(CYC1)的构建 | 第58-59页 |
| 3.4.3 与RRE和内含子相关质粒的构建 | 第59-60页 |
| 3.4.4 Rev蛋白在酿酒酵母中核定位功能的验证 | 第60-61页 |
| 3.4.5 酿酒酵母中Rev-RRE元件对平均荧光强度的影响 | 第61-64页 |
| 3.4.6 不同浓度的半乳糖对目的蛋白EGFP表达调控的影响 | 第64-65页 |
| 3.4.7 酿酒酵母中Rev-RRE元件对目的蛋白Fmi酶活的影响 | 第65-67页 |
| 3.5 本章小结 | 第67-69页 |
| 第四章 Rev-RRE元件在酿酒酵母菌中跨核膜运输T7转录产物的初步研究 | 第69-81页 |
| 4.1 引言 | 第69-70页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第70页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第70页 |
| 4.2.2 试剂与仪器 | 第70页 |
| 4.3 实验方法 | 第70-74页 |
| 4.3.1 与载体构建相关的分子生物学实验操作 | 第70页 |
| 4.3.2 载体构建流程 | 第70-72页 |
| 4.3.3 同源重组敲除遗传霉素G418基因 | 第72-73页 |
| 4.3.4 实时荧光定量分析EGFP RNA表达 | 第73页 |
| 4.3.5 SDS-PAGE和western blot检测T7 RNAP蛋白表达 | 第73页 |
| 4.3.6 共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白 | 第73-74页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第74-80页 |
| 4.4.1 重组质粒pUG-P_(T7)-EGFP-RRE-T_(T7)的构建 | 第74页 |
| 4.4.2 重组质粒pESC-T7RNAP-P_(T7)-Rev-EGFP-RRE-T_(T7)的构建 | 第74-75页 |
| 4.4.3 Rev基因整合至染色体的验证 | 第75-76页 |
| 4.4.4 RT-PCR分析EGFP RNA的表达差异 | 第76-77页 |
| 4.4.5 酿酒酵母BY4741 (Ty4::P_(CYC1)-NLS-T7RNAP-T_(CYC1); HO::P_(gal)-Rev-T_(ADH1),pUG-P_(T7)-EGFP-RRE-T_(T7))中EGFP蛋白的检测 | 第77-78页 |
| 4.4.6 酿酒酵母BY4741 (Ty4::P_(CYC1)-NLS-T7RNAP-T_(CYC1); HO::P_(gal)-Rev-T_(ADH1),pESC-T7RNAP-P_(T7)-Rev-EGFP-RRE-T_(T7))中T7 RNAP和EGFP蛋白的检测 | 第78-80页 |
| 4.5 本章小结 | 第80-81页 |
| 第五章 总结与展望 | 第81-85页 |
| 5.1 总结 | 第81-82页 |
| 5.2 展望 | 第82-85页 |
| 参考文献 | 第85-91页 |
| 附录 | 第91-95页 |
| 致谢 | 第95-97页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第97-99页 |
| 导师与作者简介 | 第99-101页 |
| 附件 | 第101-102页 |
