| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第13-15页 |
| 第一章 综述 | 第15-31页 |
| 1 H5亚型禽流感流行现状 | 第15-17页 |
| 1.1 H5亚型禽流感病毒是高致病性禽流感病毒的主要亚型之一 | 第15-16页 |
| 1.2 H5亚型禽流感病毒HA基因高度变异 | 第16-17页 |
| 1.3 H5亚型禽流感病毒抗原变异要求不断更新疫苗株 | 第17页 |
| 2 火鸡疱疹病毒载体疫苗概述 | 第17-21页 |
| 2.1 火鸡疱疹病毒作为疫苗载体的优势 | 第18页 |
| 2.2 影响火鸡疱疹病毒疫苗效果的主要因素 | 第18-21页 |
| 2.2.1 插入位点的选择 | 第18-19页 |
| 2.2.2 启动子的选择 | 第19-20页 |
| 2.2.3 插入外源蛋白的抗原性 | 第20-21页 |
| 2.3 重组AIV-火鸡疱疹病毒载体疫苗的研究进展 | 第21页 |
| 3 Mosaic疫苗概述 | 第21-27页 |
| 3.1 Mosaic疫苗的原理 | 第22页 |
| 3.2 Mosaic疫苗的获得方法 | 第22-24页 |
| 3.3 Mosaic疫苗的研究进展 | 第24-27页 |
| 3.3.1 HIV Mosaic疫苗 | 第24-25页 |
| 3.3.2 AIV Mosaic疫苗 | 第25-27页 |
| 参考文献 | 第27-31页 |
| 第二章 H5亚型禽流感病毒Mosaic HA基因重组转移质粒的构建 | 第31-51页 |
| 引言 | 第31-32页 |
| 1 材料 | 第32-33页 |
| 1.1 鸡胚 | 第32页 |
| 1.2 毒株、菌株、质粒和细胞 | 第32页 |
| 1.3 主要试剂 | 第32-33页 |
| 1.3.1 培养基 | 第32页 |
| 1.3.2 化学试剂 | 第32页 |
| 1.3.3 分子生物学试剂 | 第32-33页 |
| 1.4 主要仪器 | 第33页 |
| 1.5 主要分子生物学软件 | 第33页 |
| 2 方法 | 第33-40页 |
| 2.1 H5亚型禽流感病毒HA基因大数据分析 | 第33页 |
| 2.2 Mosaic HA蛋白序列的获得 | 第33页 |
| 2.3 Mosaic HA蛋白序列的分析 | 第33-34页 |
| 2.3.1 表位覆盖率分析 | 第33-34页 |
| 2.3.2 其他分析 | 第34页 |
| 2.4 Mosaic基因序列的合成 | 第34页 |
| 2.5 自然毒株HA基因序列的选取与克隆 | 第34-37页 |
| 2.5.1 禽流感病毒的增殖 | 第35页 |
| 2.5.2 禽流感病毒基因组RNA的提取及反转录 | 第35页 |
| 2.5.3 禽流感病毒HA基因的扩增 | 第35-37页 |
| 2.6 重组质粒的构建 | 第37-39页 |
| 2.6.1 酶切 | 第37-38页 |
| 2.6.2 连接 | 第38-39页 |
| 2.6.3 转化 | 第39页 |
| 2.6.4 重组克隆质粒的小量制备 | 第39页 |
| 2.6.5 阳性质粒鉴定 | 第39页 |
| 2.7 H5M表达性验证试验 | 第39-40页 |
| 3 结果 | 第40-49页 |
| 3.1 成功获得Mosaic序列 | 第40页 |
| 3.2 Mosaic序列的分析 | 第40-48页 |
| 3.2.1 表位覆盖率分析 | 第40-45页 |
| 3.2.2 其他分析 | 第45-48页 |
| 3.3 Mosaic序列的合成 | 第48页 |
| 3.4 质粒PCR鉴定 | 第48-49页 |
| 3.5 免疫荧光试验检测H5M的表达 | 第49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 第三章 表达H5亚型禽流感病毒Mosaic HA蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及疫苗免疫效力的评价 | 第51-72页 |
| 引言 | 第51页 |
| 1 材料 | 第51-52页 |
| 1.1 鸡胚及实验动物 | 第51页 |
| 1.2 毒株、质粒和细胞 | 第51-52页 |
| 1.3 主要试剂与仪器 | 第52页 |
| 2 方法 | 第52-60页 |
| 2.1 转染用重组转移质粒的提取 | 第52-53页 |
| 2.2 转染用rHVT-GFP基因组DNA的制备 | 第53-54页 |
| 2.2.1 rHVT-GFP细胞结合毒的复苏和培养 | 第53页 |
| 2.2.2 rHVT-GFP感染细胞总DNA的提取 | 第53-54页 |
| 2.3 磷酸钙法共转染 | 第54-56页 |
| 2.4 重组病毒的筛选、鉴定和纯化 | 第56-57页 |
| 2.4.1 重组病毒的筛选 | 第56页 |
| 2.4.2 间接免疫荧光试验(IFA) | 第56页 |
| 2.4.3 PCR与测序鉴定 | 第56-57页 |
| 2.4.4 重组病毒的亚克隆 | 第57页 |
| 2.5 重组火鸡疱疹病毒的扩大培养与冻存 | 第57-58页 |
| 2.6 遗传稳定性试验 | 第58页 |
| 2.7 重组火鸡疱疹病毒PFU的测定 | 第58页 |
| 2.8 攻毒毒株的准备 | 第58-59页 |
| 2.8.1 H5亚型禽流感病毒毒株的空斑纯化 | 第58页 |
| 2.8.2 纯化毒株测序鉴定 | 第58-59页 |
| 2.8.3 H5亚型禽流感病毒鸡胚半数感染量(EID50)测定 | 第59页 |
| 2.9 SPF鸡疫苗攻毒保护试验 | 第59-60页 |
| 2.9.1 免疫方案 | 第59-60页 |
| 2.9.2 抗体水平检测 | 第60页 |
| 2.9.3 SPF鸡攻毒保护试验 | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-69页 |
| 3.1 重组火鸡疱疹病毒的获得 | 第60页 |
| 3.2 重组火鸡疱疹病毒的鉴定 | 第60-62页 |
| 3.2.1 间接免疫荧光试验(IFA) | 第60-61页 |
| 3.2.2 PCR检测重组病毒外源基因 | 第61-62页 |
| 3.3 遗传稳定性试验 | 第62页 |
| 3.4 HI抗体水平检测 | 第62-63页 |
| 3.5 攻毒保护率 | 第63-65页 |
| 3.5.1 rHVT-H-H5M的交叉保护性 | 第63页 |
| 3.5.2 强启动子比弱启动子更具有优势 | 第63-65页 |
| 3.6 攻毒后排毒情况 | 第65-69页 |
| 3.6.1 排毒率 | 第65-67页 |
| 3.6.2 喉头和泄殖腔排毒水平 | 第67-69页 |
| 4 讨论 | 第69-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 全文小结 | 第76-77页 |
| 附录 | 第77-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第81-82页 |
