| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 结直肠癌干细胞增殖依赖线粒体呼吸链 | 第11-69页 |
| 前言 | 第11-17页 |
| 1. 线粒体呼吸链 | 第11-12页 |
| 2. 线粒体呼吸链调节信号 | 第12-13页 |
| 3. 肿瘤细胞能量代谢 | 第13-15页 |
| 4. 结直肠癌干细胞研究 | 第15-17页 |
| 一、材料与方法 | 第17-31页 |
| (一) 实验材料 | 第17-22页 |
| 1. 试剂耗材 | 第17-21页 |
| (1) 肿瘤细胞培养材料 | 第17页 |
| (2) 肿瘤干细胞培养材料 | 第17-18页 |
| (3) 结直肠癌干细胞分离纯化材料 | 第18页 |
| (4) 实时荧光定量PCR材料 | 第18-19页 |
| (5) 蛋白免疫印迹(Western blot)材料 | 第19页 |
| (6) 结直肠癌干细胞标记物流式检测材料 | 第19-20页 |
| (7) 线粒体内膜染色流式分析材料 | 第20页 |
| (8) 线粒体活性氧自由基流式分析材料 | 第20页 |
| (9) 线粒体呼吸链复合物V活性检测材料 | 第20页 |
| (10) 透射电子显微镜实验材料 | 第20页 |
| (11) 细胞活性检测实验材料 | 第20页 |
| (12) 成瘤实验材料 | 第20页 |
| (13) 慢病毒感染细胞株材料 | 第20-21页 |
| 2. 仪器设备 | 第21-22页 |
| (二) 实验方法 | 第22-31页 |
| 1. 结直肠癌细胞株培养 | 第22页 |
| 2. 结直肠癌干细胞分离和培养 | 第22-23页 |
| 3. 实时荧光定量PCR | 第23-24页 |
| 4. 蛋白免疫印迹(Western blot) | 第24-26页 |
| 5. 细胞流式检测肿瘤干细胞标记物 | 第26-27页 |
| 6. 细胞流式分析线粒体内膜染色 | 第27-28页 |
| 7. 细胞流式分析检测线粒体活性氧自由基 | 第28页 |
| 8. 呼吸链复合物V活性检测 | 第28页 |
| 9. 透射电子显微镜观察线粒体 | 第28-29页 |
| 10. 细胞活性检测 | 第29页 |
| 11. 免疫缺陷鼠成瘤实验 | 第29-30页 |
| 12. 慢病毒细胞株的建立 | 第30页 |
| 13. Oncomine临床数据分析 | 第30-31页 |
| 二、结果 | 第31-60页 |
| (一) 结直肠癌细胞线粒体呼吸链基因表达和调节信号 | 第31-37页 |
| 1. 结直肠癌组织的呼吸链复合物蛋白低表达 | 第31-34页 |
| 2. 结直肠癌组织的呼吸链上游信号受到抑制 | 第34-36页 |
| 3. 不同结直肠癌细胞株的呼吸链蛋白表达 | 第36-37页 |
| (二) 结直肠癌干细胞线粒体呼吸链分子和功能特征,以及对细胞活性的支 | 第37-60页 |
| 1. 结直肠癌细胞株的肿瘤干细胞含量 | 第37-38页 |
| 2. 肿瘤干细胞缺失对结直肠癌细胞成瘤性的影响 | 第38-39页 |
| 3. 结直肠癌干细胞的分离培养和鉴定 | 第39-41页 |
| 4. 结直肠癌干细胞的线粒体呼吸链基因表达 | 第41-43页 |
| 5. 结直肠癌干细胞的呼吸链复合物V的酶活性 | 第43-44页 |
| 6. 结直肠癌干细胞的线粒体活性氧自由基 | 第44-46页 |
| 7. 结直肠癌干细胞的线粒体内膜 | 第46-49页 |
| 8. 结直肠癌干细胞的线粒体形态 | 第49-51页 |
| 9. 干扰核编码呼吸链蛋白表达对结直肠癌细胞的影响 | 第51-54页 |
| 10. 结直肠癌干细胞活性依赖线粒体呼吸链 | 第54-60页 |
| 三、结论 | 第60-61页 |
| 四、讨论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 第二章 肾上腺素和糖皮质激素调节结直肠癌干细胞增殖 | 第69-89页 |
| 前言 | 第69-73页 |
| 一、材料与方法 | 第73-76页 |
| (一) 实验材料 | 第73-74页 |
| 1. 试剂耗材 | 第73-74页 |
| (1) 蛋白免疫印迹(Western blot)材料 | 第73页 |
| (2) 线粒体膜电位流式分析材料 | 第73页 |
| (3) 糖皮质激素受体(GR)稳定干扰细胞株构建 | 第73页 |
| (4) 细胞增殖活性检测实验材料 | 第73-74页 |
| 2. 仪器设备 | 第74页 |
| (二) 实验方法 | 第74-76页 |
| 1. 细胞流式分析线粒体膜电位 | 第74-75页 |
| 2. 结直肠癌干细胞增殖活性检测 | 第75页 |
| 3. Oncomine临床数据分析 | 第75-76页 |
| 二、结果 | 第76-86页 |
| (一) 临床样本中肾上腺素、去甲肾上腺素和糖皮质激素代谢和受体表达 | 第76-77页 |
| 1. 临床结直肠癌组织肾上腺素代谢 | 第76-77页 |
| (二) 肾上腺素、去甲肾上腺素和糖皮质激素受体在结直肠癌组织的表达 | 第77-78页 |
| (三) 肾上腺素、去甲肾上腺素对线粒体功能特征的影响 | 第78-80页 |
| 1. 肾上腺素、去甲肾上腺素处理增加线粒体膜电位 | 第78-79页 |
| 2. 肾上腺素影响线粒体呼吸链蛋白表达 | 第79-80页 |
| (四) 肾上腺素、去甲肾上腺素与结直肠癌细胞异质性 | 第80-82页 |
| 1. 肾上腺素增加体外培养结直肠癌细胞的肿瘤干细胞比例 | 第80-81页 |
| 2. 去甲肾上腺素增加体外培养结直肠癌细胞的肿瘤干细胞比例 | 第81-82页 |
| 3. 肾上腺素降低体外培养结直肠癌细胞内的胚胎干细胞标记物表达 | 第82页 |
| (五) 糖皮质激素受体表达影响体外培养结直肠癌干细胞比例 | 第82-83页 |
| (六) 肾上腺素、去甲肾上腺素与糖皮质激素对结直肠癌干细胞增殖的影响 | 第83-86页 |
| 1. 糖皮质激素处理和受体拮抗对结直肠癌干细胞增殖的影响 | 第83-84页 |
| 2. 肾上腺素、去甲肾上腺素及其受体拮抗对结直肠癌干细胞增殖的影 | 第84-86页 |
| 三、讨论 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-89页 |
| 第三章 分子钟节律调节结直肠癌细胞增殖 | 第89-111页 |
| 前言 | 第89-92页 |
| 一、材料和方法 | 第92-94页 |
| (一) 实验材料 | 第92-93页 |
| (二) 实验方法 | 第93-94页 |
| 二、结果 | 第94-107页 |
| (一) 结直肠癌组织的节律钟基因表达的变化 | 第94-96页 |
| 1. 结直肠癌组织节律钟CLOCK家族基因mRNA的表达 | 第94-95页 |
| 2. 结直肠癌组织节律钟负反馈环基因mRNA的表达 | 第95-96页 |
| (二) 体外培养结直肠癌细胞的节律钟节律 | 第96-97页 |
| 1. 结直肠癌细胞节律钟CLOCK家族基因的mRNA节律表达 | 第96页 |
| 2. 结直肠癌细胞节律钟负反馈环基因的mRNA节律表达 | 第96-97页 |
| (三) Xenograft模型下肿瘤和宿主结直肠的节律钟节律比较 | 第97-100页 |
| 1. Xenograft肿瘤和宿主结直肠节律钟CLOCK家族基因的mRNA节律表达 | 第97-98页 |
| 2. Xenograt肿瘤和宿主结直肠节律钟负反馈环基因的mRNA节律表达 | 第98-99页 |
| 3. Xenograft肿瘤的节律钟蛋白节律表达 | 第99-100页 |
| 4. Xenograft宿主结直肠节律钟蛋白的节律表达 | 第100页 |
| (四) 临床结直肠癌组织节律钟基因的昼夜表达差异 | 第100-101页 |
| (五) 节律钟节律与结直肠癌干细胞 | 第101-103页 |
| (六) 结直肠癌细胞对节律钟负反馈环的敏感性 | 第103-107页 |
| 1. 结直肠癌细胞对节律钟负反馈环蛋白降解抑制剂敏感 | 第103-104页 |
| 2. PER家族蛋白PER3的RNA干扰不影响结直肠癌细胞的增殖活性 | 第104-105页 |
| 3. PER家族蛋白PER3的RNA干扰降低了结直肠癌细胞HT29对节律钟负反馈环蛋白降解抑制剂敏感性 | 第105-106页 |
| 4. PER家族蛋白PER3的RNA干扰增加了结直肠癌细胞HCT116对节律钟负反馈环蛋白降解抑制剂敏感性 | 第106-107页 |
| 三、讨论 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-111页 |
| 第四章 昼夜节律调节线粒体呼吸链影响结直肠癌干细胞增殖 | 第111-142页 |
| 前言 | 第111-115页 |
| 一、材料与方法 | 第115-116页 |
| 二、实验结果 | 第116-137页 |
| (一) 结直肠癌细胞线粒体呼吸链表达的昼夜节律性 | 第116-128页 |
| 1. 临床结直肠癌组织线粒体呼吸链蛋白和CLOCK表达的比较 | 第116-121页 |
| 2. 结直肠癌组织呼吸链蛋白表达的昼夜节律性 | 第121页 |
| 3. 结直肠癌细胞Xenograft模型下呼吸链表达的昼夜节律性 | 第121-122页 |
| 4. 体外培养结直肠癌细胞呼吸链表达的昼夜节律性 | 第122-123页 |
| 5. 节律钟基因PER3调节线粒体呼吸链蛋白表达 | 第123-125页 |
| 6. 节律钟基因PER3对线粒体呼吸链的调节影响结直肠癌细胞的增殖活性 | 第125-128页 |
| (二) 结直肠癌干细胞线粒体呼吸链具有昼夜节律性 | 第128-137页 |
| 1. 结直肠癌干细胞线粒体呼吸链表达的昼夜节律性 | 第128-129页 |
| 2. 干扰结直肠癌干细胞节律钟基因PER3表达对其他节律钟基因和呼吸链蛋白的影响 | 第129-130页 |
| 3. 节律钟基因PER3调节结直肠癌干细胞的增殖活性 | 第130页 |
| 4. PER3稳定干扰降低了Oligomycin和KL001对结直肠癌干细胞增殖的抑制作用 | 第130-137页 |
| 三、讨论 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-142页 |
| 全文结果和创新点总结 | 第142-143页 |
| 攻读博士学位期间完成的科研成果 | 第143-144页 |
| 发表论文 | 第143页 |
| 科研项目 | 第143-144页 |
| 致谢 | 第144页 |
