| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-28页 |
| 1.1 Bst DNA聚合酶简介 | 第11-17页 |
| 1.1.1 DNA聚合酶的分类 | 第11页 |
| 1.1.2 DNA聚合酶A家族 | 第11-14页 |
| 1.1.3 Bst DNA聚合酶的结构 | 第14-15页 |
| 1.1.4 Bst DNA聚合酶的作用机制 | 第15-17页 |
| 1.2 DNA聚合酶的改造方法 | 第17-20页 |
| 1.2.1 定向进化技术 | 第17-19页 |
| 1.2.2 定点突变技术 | 第19页 |
| 1.2.3 定点突变的方法 | 第19-20页 |
| 1.3 Bst DNA聚合酶的应用 | 第20-22页 |
| 1.3.1 等温扩增技术的优点 | 第20-21页 |
| 1.3.2 环介导等温扩增技术 | 第21-22页 |
| 1.3.3 等温多自配引发扩增技术 | 第22页 |
| 1.4 Bst DNA聚合酶活性测定方法 | 第22-25页 |
| 1.4.1 颜色判定法 | 第22-23页 |
| 1.4.2 实时荧光法 | 第23-24页 |
| 1.4.3 Bst DNA聚合酶动力学参数的测定方法 | 第24-25页 |
| 1.5 本论文研究背景、主要内容及意义 | 第25-28页 |
| 1.5.1 研究背景及意义 | 第25-26页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第26-27页 |
| 1.5.3 技术路线 | 第27-28页 |
| 第二章 野生型Bst DNA聚合酶在E.coli中的表达与纯化 | 第28-48页 |
| 2.1 引言 | 第28页 |
| 2.2 实验材料 | 第28-32页 |
| 2.2.1 基因、引物及载体 | 第28-29页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第29-30页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第30-31页 |
| 2.2.4 常用培养基及溶液的配制 | 第31-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.3.1 Bst目的基因的获得 | 第32-34页 |
| 2.3.2 pET21a与Bst基因分别双酶切 | 第34-36页 |
| 2.3.3 转化 | 第36-37页 |
| 2.3.4 重组质粒pET21a-Bst的鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.5 重组蛋白表达 | 第38-40页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE检测 | 第40页 |
| 2.3.7 蛋白纯化 | 第40-42页 |
| 2.3.8 纯化后蛋白的透析脱盐 | 第42页 |
| 2.3.9 纯化脱盐后蛋白浓度测定及纯度分析 | 第42-43页 |
| 2.4 实验结果 | 第43-47页 |
| 2.4.1 Bst基因扩增结果 | 第43页 |
| 2.4.2 菌落PCR结果 | 第43-44页 |
| 2.4.3 pET21a-Bst重组质粒的双酶切鉴定及测序分析 | 第44-45页 |
| 2.4.4 Bst DNA聚合酶的小量表达 | 第45页 |
| 2.4.5 诱导条件优化及WB鉴定 | 第45-46页 |
| 2.4.6 Bst DNA聚合酶纯化 | 第46-47页 |
| 2.4.7 蛋白浓度测定及纯度分析 | 第47页 |
| 2.5 本章小结 | 第47-48页 |
| 第三章 定点突变改造Bst DNA聚合酶 | 第48-65页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 实验方法 | 第48-54页 |
| 3.2.1 同源建模预测Bst DNA聚合酶的活性位点 | 第48-50页 |
| 3.2.2 突变位点的选取 | 第50-51页 |
| 3.2.3 RF克隆法构建各突变体 | 第51-53页 |
| 3.2.4 转化 | 第53-54页 |
| 3.2.5 各个突变体的表达与纯化 | 第54页 |
| 3.3 实验结果 | 第54-64页 |
| 3.3.1 同源建模 | 第54-56页 |
| 3.3.2 突变体菌落PCR | 第56-57页 |
| 3.3.3 突变体小量表达的结果 | 第57-59页 |
| 3.3.4 突变体大量表达纯化结果 | 第59-63页 |
| 3.3.5 Bst DNA聚合酶的浓度及纯度测定 | 第63-64页 |
| 3.4 本章小结 | 第64-65页 |
| 第四章 Bst DNA聚合酶的应用及其酶活检测 | 第65-82页 |
| 4.1 引言 | 第65-66页 |
| 4.2 实验方法 | 第66-71页 |
| 4.2.1 核酸提取 | 第66页 |
| 4.2.2 cDNA的制备 | 第66-69页 |
| 4.2.3 IMSA反应 | 第69-70页 |
| 4.2.4 HNB染色法定性检测酶活 | 第70页 |
| 4.2.5 荧光法检测酶的反应速率 | 第70-71页 |
| 4.2.6 IP-RPLC法定量检测酶活并对Kcat值进行研究 | 第71页 |
| 4.3 实验结果 | 第71-80页 |
| 4.3.1 HNB染色法定性检测酶活 | 第71-72页 |
| 4.3.2 荧光法检测酶的反应速率 | 第72-74页 |
| 4.3.3 IP-RPLC法定量检测酶活并对Kcat值进行研究 | 第74-80页 |
| 4.4 本章小结 | 第80-82页 |
| 结论与展望 | 第82-85页 |
| 1 结论 | 第82-83页 |
| 2 创新点 | 第83页 |
| 3 展望 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-90页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 附件 | 第92页 |
