| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 食线虫真菌及lncRNA在真菌中的研究进展 | 第16-36页 |
| 1 食线虫真菌研究进展 | 第16-19页 |
| 1.1 捕食线虫真菌是研究真菌生活史转化不可多得的好材料 | 第16页 |
| 1.2 捕食线虫真菌是植物寄生线虫的天敌 | 第16-17页 |
| 1.3 捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制研究进展 | 第17-19页 |
| 2 lncRNAs的简介 | 第19-27页 |
| 2.1 lncRNAs的结构特点及分类 | 第20页 |
| 2.2 lncRNAs的调控机制及功能研究 | 第20-22页 |
| 2.3 真菌中的lncRNAs研究进展 | 第22-27页 |
| 3 如何发现lncRNAs | 第27-34页 |
| 3.1 RNA-seq技术是发现lncRNAs的首选 | 第27页 |
| 3.2 RNA降解机制有助于发现更多lncRNAs | 第27-34页 |
| 4 本论文的选题依据和研究意义 | 第34-36页 |
| 第二章 基于RNA-seq技术发掘寡孢节丛孢形成捕食器官过程中的lncRNAs | 第36-59页 |
| 1 前言 | 第36页 |
| 2 实验材料 | 第36-37页 |
| 2.1 实验菌株 | 第36页 |
| 2.2 主要药品和培养基 | 第36-37页 |
| 2.3 主要仪器和设备 | 第37页 |
| 3 研究方法 | 第37-42页 |
| 3.1 实验菌株的培养 | 第37页 |
| 3.2 诱导线虫的培养与制备 | 第37-38页 |
| 3.3 捕食器官的诱导及观察 | 第38-39页 |
| 3.3.1 线虫提取液的制备 | 第38页 |
| 3.3.2 孢子培养与收集 | 第38-39页 |
| 3.3.3 捕食器官的诱导及样品收集 | 第39页 |
| 3.4 高通量测序样品的制备 | 第39页 |
| 3.4.1 RNA样品提取 | 第39页 |
| 3.4.2 RNA文库构建 | 第39页 |
| 3.5 RNA-seq测序及数据分析方法 | 第39-42页 |
| 3.5.1 RNA-seq测序数据质量评估 | 第40页 |
| 3.5.2 参考序列比对分析 | 第40页 |
| 3.5.3 Reads在已知类型的基因分布情况 | 第40页 |
| 3.5.4 表达水平分析 | 第40页 |
| 3.5.5 RNA-Seq相关性检查 | 第40页 |
| 3.5.6 转录本拼接 | 第40页 |
| 3.5.7 候选lncRNAs的筛选 | 第40-41页 |
| 3.5.7.1 基本筛选 | 第40-41页 |
| 3.5.7.2 编码潜能筛选 | 第41页 |
| 3.5.8 lncRNAs靶基因预测 | 第41页 |
| 3.5.9 差异表达lncRNA靶基因KEGG富集分析 | 第41页 |
| 3.5.10 差异表达mRNA富集分析 | 第41-42页 |
| 3.5.10.1 差异表达mRNA GO富集分析 | 第41页 |
| 3.5.10.2 差异表达mRNA KEGG富集分析 | 第41-42页 |
| 3.5.11 lncRNA与mRNA的表达水平比较 | 第42页 |
| 4 结果 | 第42-58页 |
| 4.1 线虫提取物诱导产生捕食器官的结果 | 第42页 |
| 4.2 RNA提取及纯化结果 | 第42-44页 |
| 4.3 RNA-seq测序数据产出 | 第44-45页 |
| 4.4 Reads与参考基因组比对情况统计 | 第45页 |
| 4.5 Reads在已知类型的基因分布情况 | 第45-46页 |
| 4.6 表达水平对比分析 | 第46页 |
| 4.7 RNA-Seq相关性检查 | 第46-47页 |
| 4.8 候选lncRNA的筛选 | 第47-50页 |
| 4.8.1 基本筛选 | 第47-49页 |
| 4.8.2 编码潜能筛选 | 第49-50页 |
| 4.9 lncRNA表达水平分析 | 第50-51页 |
| 4.10 差异表达lncRNA靶基因KEGG富集分析 | 第51-54页 |
| 4.11 差异表达mRNA富集分析 | 第54-56页 |
| 4.11.1 差异表达mRNA GO富集分析 | 第54-55页 |
| 4.11.2 差异表达mRNA KEGG富集表达聚类 | 第55-56页 |
| 4.12 lncRNA和mRNA的表达水平比较 | 第56-58页 |
| 6 小结 | 第58-59页 |
| 第三章 寡孢节丛孢中RNA降解途径中关键基因敲除载体构建 | 第59-74页 |
| 1 前言 | 第59-60页 |
| 2 实验材料与设备 | 第60-61页 |
| 2.1 实验菌株和载体 | 第60页 |
| 2.2 主要溶液和培养基 | 第60页 |
| 2.3 实验试剂和药品 | 第60-61页 |
| 2.4 实验仪器和设备 | 第61页 |
| 3 实验方法 | 第61-66页 |
| 3.1 RNA降解途径关键蛋白序列来源 | 第61页 |
| 3.2 敲除载体的构建 | 第61-62页 |
| 3.3 敲除载体转化子的验证 | 第62页 |
| 3.4 敲除基因载体构建引物及验证引物设计 | 第62页 |
| 3.5 寡孢节丛孢野生型基因组DNA提取 | 第62页 |
| 3.6 pCSN44质粒的提取 | 第62-63页 |
| 3.7 扩增目的基因片段 | 第63-64页 |
| 3.7.1 5'端和3'端同源片段及的PCR扩增(5个基因公用) | 第63页 |
| 3.7.2 潮霉素抗性基因(hph)PCR扩增 | 第63-64页 |
| 3.8 酶切pRS426获得线性化质粒 | 第64页 |
| 3.9 酵母感受态制备及电转 | 第64页 |
| 3.9.1 酿酒酵母感受态细胞的制备 | 第64页 |
| 3.9.2 清洗电转杯 | 第64页 |
| 3.9.3 酵母感受态细胞电转化 | 第64页 |
| 3.10 酵母转化子的验证 | 第64-65页 |
| 3.11 化学转化酵母转化子质粒 | 第65页 |
| 3.12 全长敲除片段的扩增 | 第65-66页 |
| 4 实验结果与分析 | 第66-72页 |
| 4.1 5个敲除载体的引物设计结果 | 第66-69页 |
| 4.2 5个基因上、下游片段和hph基因的扩增及酶切pRS426质粒检测 | 第69页 |
| 4.3 电转化酵母结果 | 第69-70页 |
| 4.4 大肠杆菌转化子的验证 | 第70-71页 |
| 4.5 敲除全长扩增 | 第71-72页 |
| 5 讨论 | 第72-73页 |
| 6 小结 | 第73-74页 |
| 第四章 寡孢节丛孢原生质体的制备、转化及转化子的筛选和验证 | 第74-85页 |
| 1. 前言 | 第74-75页 |
| 2 实验材料 | 第75-76页 |
| 2.1 实验菌株 | 第75页 |
| 2.2 实验药品和试剂盒 | 第75页 |
| 2.3 实验培养基和溶液 | 第75-76页 |
| 2.4 实验仪器 | 第76页 |
| 3 实验方法 | 第76-81页 |
| 3.1 寡孢节丛孢原生质体的制备 | 第76页 |
| 3.2 原生质体转化 | 第76-77页 |
| 3.3 原生质体转化子基因组的提取 | 第77页 |
| 3.4 敲除转化子的PCR验证 | 第77页 |
| 3.5 敲除转化子的Southern blot验证 | 第77-81页 |
| 3.5.1 确定酶切位点和设计探针 | 第78页 |
| 3.5.2 制备探针 | 第78-79页 |
| 3.5.3 酶切基因组 | 第79-80页 |
| 3.5.4 酶切基因组电泳 | 第80页 |
| 3.5.5 Southern blot | 第80-81页 |
| 3.5.5.1 转膜 | 第80页 |
| 3.5.5.2 膜的紫外交联 | 第80页 |
| 3.5.5.3 预杂交、杂交和洗膜 | 第80-81页 |
| 3.5.5.4 显影和照胶 | 第81页 |
| 4 结果与分析 | 第81-83页 |
| 4.1 转化子PCR验证 | 第81页 |
| 4.2 转化子Southern blot验证 | 第81-83页 |
| 4.2.1 制备核酸探针 | 第81-82页 |
| 4.2.2 基因组酶切检测 | 第82页 |
| 4.2.3 Southern blot结果 | 第82-83页 |
| 5 讨论 | 第83-84页 |
| 5.1 原生质体制备及转化 | 第83页 |
| 5.2 敲除转化子的PCR验证 | 第83页 |
| 5.3 敲除转化子的Southern blot验证 | 第83-84页 |
| 6 小结 | 第84-85页 |
| 第五章 寡孢节丛孢WT菌株与ΔRrp6敲除株的表型特征比较和分析 | 第85-97页 |
| 1 前言 | 第85页 |
| 2 实验材料及仪器 | 第85页 |
| 2.1 实验菌株 | 第85页 |
| 2.2 主要培养基 | 第85页 |
| 2.3 主要试剂 | 第85页 |
| 2.4 主要仪器及设备 | 第85页 |
| 3 实验方法 | 第85-87页 |
| 3.1 生长速率的比较 | 第85-86页 |
| 3.2 逆境生长情况比较 | 第86页 |
| 3.3 产孢子数量比较 | 第86页 |
| 3.4 活线虫诱导产捕食器比较 | 第86页 |
| 3.4.1 线虫的收集和表面消毒 | 第86页 |
| 3.4.2 诱导捕食器产生 | 第86页 |
| 3.5 杀线虫能力比较 | 第86-87页 |
| 3.6 电镜观察菌丝形态比较 | 第87页 |
| 4 实验结果 | 第87-95页 |
| 4.1 生长速率的比较 | 第87-89页 |
| 4.2 逆境条件生长情况比较 | 第89-91页 |
| 4.3 产孢量的比较 | 第91-92页 |
| 4.4 产捕食器数量比较 | 第92-94页 |
| 4.5 杀线虫活力比较 | 第94页 |
| 4.6 电镜观察结果 | 第94-95页 |
| 5 讨论 | 第95-96页 |
| 5.1 生长速率的比较 | 第95页 |
| 5.2 抗逆性的比较 | 第95页 |
| 5.3 产孢量的比较 | 第95-96页 |
| 5.4 产捕食器数量比较 | 第96页 |
| 5.5 杀线虫活力比较 | 第96页 |
| 5.6 电镜观察比较 | 第96页 |
| 6 小结 | 第96-97页 |
| 全文小结与展望 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-109页 |
| 附录 | 第109-112页 |
| 附录1 论文中使用的缩写及中英文对照 | 第109-110页 |
| 附录2 论文中使用的质粒图谱 | 第110-111页 |
| 附录3 硕士阶段参与科研项目和参与发表的学术论文 | 第111-112页 |
| 致谢 | 第112页 |
