| 第一章 前言 | 第12-61页 |
| 第一节 脂肪酶 | 第12-21页 |
| 1. 脂肪酶简介 | 第12-14页 |
| 2. 脂肪酶的基因研究 | 第14-15页 |
| 3. 脂肪酶的催化机理 | 第15-16页 |
| 4. 脂肪酶的性质研究 | 第16-18页 |
| 5. 脂肪酶的应用研究 | 第18-21页 |
| 第二节 枯草杆菌 | 第21-30页 |
| 1. 枯草杆菌简介 | 第21-22页 |
| 2. 枯草杆菌基因表达系统 | 第22-27页 |
| 3. 外源蛋白在枯草杆菌中的表达机制 | 第27-29页 |
| 4. 影响枯草杆菌基因表达的因素与解决对策 | 第29-30页 |
| 第三节 非水酶学 | 第30-35页 |
| 1. 非水相酶催化的优点 | 第30-31页 |
| 2. 非水相酶催化反应的影响因素 | 第31-35页 |
| 第四节 定向进化 | 第35-46页 |
| 1. 定向进化的原理 | 第35页 |
| 2. 定向进化的策略 | 第35-42页 |
| 3. 定向进化的筛选策略 | 第42-43页 |
| 4. 定向进化的应用 | 第43-46页 |
| 第五节 本论文的立题依据和研究内容 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-61页 |
| 第二章 枯草杆菌脂肪酶的基因克隆、表达纯化与表征 | 第61-102页 |
| 第一节 引言 | 第61-62页 |
| 第二节 枯草杆菌脂肪酶重组质粒的构建 | 第62-79页 |
| 1、实验材料 | 第63-66页 |
| 2、实验方法 | 第66-74页 |
| 2.1 双链DNA的合成 | 第66页 |
| 2.2 质粒 DNA 的小量制备 | 第66-67页 |
| 2.3 从琼脂糖凝胶中回收DNA | 第67-68页 |
| 2.4 从细菌中小量制备基因组DNA | 第68页 |
| 2.5 引物设计 | 第68-69页 |
| 2.6 目的基因的PCR 扩增和纯化 | 第69页 |
| 2.7 PCR 产物的酶切和纯化 | 第69-70页 |
| 2.8 载体DNA 的限制性酶切、纯化和去磷酸化 | 第70-71页 |
| 2.9 目的基因与载体的连接 | 第71页 |
| 2.10 枯草杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第71-72页 |
| 2.11 单克隆菌株的筛选与鉴定 | 第72页 |
| 2.12 目的基因的序列测定 | 第72-74页 |
| 3、结果与讨论 | 第74-79页 |
| 3.1 引入 DNA 片段的设计与获得 | 第74-75页 |
| 3.2 重组质粒的构建 | 第75-79页 |
| 3.2.1 质粒载体的提取、酶切、纯化及磷酸化处理 | 第76页 |
| 3.2.2 目的基因的克隆、限制性酶切及纯化 | 第76-77页 |
| 3.2.3 目的基因与引入的DNA 片段、质粒载体的连接 | 第77-78页 |
| 3.2.4 重组质粒的转化及鉴定 | 第78-79页 |
| 第三节 枯草杆菌脂肪酶的表达与纯化 | 第79-90页 |
| 1、实验材料 | 第79-81页 |
| 2、实验方法 | 第81-85页 |
| 2.1 生长表达曲线 | 第81页 |
| 2.2 脂肪酶粗酶的制备 | 第81-82页 |
| 2.3 脂肪酶的分离纯化 | 第82页 |
| 2.4 脂肪酶的活力测定 | 第82-83页 |
| 2.5 蛋白浓度的测定 | 第83页 |
| 2.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第83-84页 |
| 2.7 蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第84-85页 |
| 3、结果与讨论 | 第85-90页 |
| 3.1 枯草杆菌生长表达曲线 | 第85-86页 |
| 3.2 脂肪酶的分离纯化 | 第86-89页 |
| 3.3 纯化脂肪酶的 SDS-PAGE 电泳和活力染色 | 第89-90页 |
| 第四节 枯草杆菌脂肪酶的基本酶学性质 | 第90-99页 |
| 1、实验材料 | 第90-91页 |
| 2、实验方法 | 第91-93页 |
| 2.1 温度对酶活力的影响 | 第91页 |
| 2.2 pH 对酶活力的影响 | 第91页 |
| 2.3 脂肪酶的稳定性 | 第91页 |
| 2.4 酶反应动力学 | 第91-92页 |
| 2.5 底物特异性 | 第92页 |
| 2.6 金属离子和表面活性剂对酶活力的影响 | 第92页 |
| 2.7 胆酸钠盐对酶活力的影响 | 第92页 |
| 2.8 酶活力测定 | 第92-93页 |
| 3、结果与讨论 | 第93-99页 |
| 3.1 温度对酶活力的影响 | 第93-94页 |
| 3.2 pH 对酶活力的影响 | 第94-95页 |
| 3.3 底物特异性 | 第95-96页 |
| 3.4 酶反应动力学 | 第96-97页 |
| 3.5 金属离子和表面活性剂对酶活力的影响 | 第97-98页 |
| 3.6 胆酸钠盐对酶活力的影响 | 第98-99页 |
| 本章小结 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-102页 |
| 第三章 枯草杆菌脂肪酶的定向进化 | 第102-127页 |
| 第一节 引言 | 第102-103页 |
| 第二节 易错 PCR 和 DNA 重组对枯草杆菌脂肪酶的定向进化. | 第103-124页 |
| 1、实验材料 | 第103-106页 |
| 2、实验方法 | 第106-114页 |
| 2.1 质粒 DNA 的小量制备 | 第106-107页 |
| 2.2 从琼脂糖凝胶中回收 DNA | 第107页 |
| 2.3 从细菌中小量制备基因组 DNA | 第107-108页 |
| 2.4 引物设计 | 第108页 |
| 2.5 易错 PCR | 第108-109页 |
| 2.6 DNA 改组 | 第109-110页 |
| 2.7 易错PCR 和 DNA 重组产物的酶切和纯化 | 第110-111页 |
| 2.8 载体 DNA 的限制性酶切、纯化和去磷酸化 | 第111-112页 |
| 2.9 突变库的构建 | 第112-113页 |
| 2.10 高活力菌株的筛选 | 第113页 |
| 2.11 突变体活力测定 | 第113页 |
| 2.12 脂肪酶的分离纯化 | 第113页 |
| 2.13 突变体的热稳定性 | 第113页 |
| 2.14 突变体的pH 稳定性 | 第113页 |
| 2.15 突变基因的序列测定 | 第113-114页 |
| 3、实验结果 | 第114-122页 |
| 3.1 易错 PCR 突变库的构建和筛选结果 | 第114-115页 |
| 3.2 DNA 重组突变库的构建和筛选结果 | 第115-116页 |
| 3.3 突变体的最适温度和稳定性 | 第116-117页 |
| 3.4 突变体的最适pH 值和稳定性 | 第117-118页 |
| 3.5 突变体的基因的序列测定及蛋白质结构预测 | 第118-122页 |
| 4、讨论 | 第122-124页 |
| 4.1 突变库的库容 | 第122-123页 |
| 4.2 筛选方法 | 第123页 |
| 4.3 定向进化方案 | 第123-124页 |
| 本章小结 | 第124-125页 |
| 参考文献 | 第125-127页 |
| 第四章 枯草杆菌脂肪酶的非水酶学 | 第127-153页 |
| 第一节 引言 | 第127-128页 |
| 第二节 枯草杆菌脂肪酶催化乙酸乙烯酯拆分(R,S)-2-辛醇 | 第128-142页 |
| 1、实验材料 | 第128-130页 |
| 2、实验方法 | 第130-133页 |
| 2.1 酶催化的(R,S)-2-辛醇酯交换反应 | 第130页 |
| 2.2 溶剂及脂肪酶含水量的测定 | 第130页 |
| 2.3 有机溶剂干燥除水 | 第130页 |
| 2.4 制备一定pH 和离子强度的冻干酶粉 | 第130页 |
| 2.5 底物转化率的测定 | 第130-131页 |
| 2.6 2-辛醇的光学纯度(ee)测定 | 第131-132页 |
| 2.7 酶立体选择性(Eantiomeric ratio,E 值)的测定 | 第132页 |
| 2.8 产物的分离 | 第132-133页 |
| 2.9 光学纯度检验 | 第133页 |
| 3、实验结果与讨论 | 第133-142页 |
| 3.1 底物摩尔比对催化拆分(R,S)-2-辛醇的影响 | 第133-134页 |
| 3.2 酶量对催化拆分(R,S)-2-辛醇的影响 | 第134-136页 |
| 3.3 温度对催化拆分(R,S)-2-辛醇的影响 | 第136-137页 |
| 3.4 反应进程的分析 | 第137-139页 |
| 3.5 酶分子微环境的影响 | 第139-142页 |
| 3.5.1 冻干酶粉pH的影响 | 第139-140页 |
| 3.5.2 冻干酶粉离子强度的影响 | 第140-142页 |
| 第三节 枯草杆菌脂肪酶催化双乙烯酮拆分(R,S)-2-辛醇 | 第142-150页 |
| 1、实验材料 | 第143页 |
| 2、实验方法 | 第143-145页 |
| 2.1 酶催化的(R,S)-2-辛醇酯交换反应 | 第143页 |
| 2.2 溶剂及脂肪酶含水量的测定 | 第143页 |
| 2.3 有机溶剂干燥除水 | 第143页 |
| 2.4 脂肪酶活力测定 | 第143-144页 |
| 2.5 底物转化率的测定 | 第144页 |
| 2.6 2-辛醇的光学纯度(ee)测定 | 第144页 |
| 2.7 酶立体选择性(Eantiomeric ratio,E 值)的测定 | 第144页 |
| 2.8 产物的分离 | 第144页 |
| 2.9 光学纯度检验 | 第144页 |
| 2.10 温度对拆分产率的影响 | 第144页 |
| 2.11 水含量对拆分的影响 | 第144-145页 |
| 3、实验结果与讨论 | 第145-150页 |
| 3.1 底物摩尔比的影响 | 第145-146页 |
| 3.2 酶浓度的影响 | 第146-147页 |
| 3.3 反应体系中溶剂的影响 | 第147页 |
| 3.4 反应温度的影响 | 第147-148页 |
| 3.5 水含量的影响 | 第148-150页 |
| 本章小结 | 第150-151页 |
| 参考文献 | 第151-153页 |
| 作者简历 | 第153-155页 |
| 致谢 | 第155-156页 |
| 中文摘要 | 第156-160页 |
| 英文摘要 | 第160页 |
