| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-28页 |
| 1.1 CRISPR/Cas9系统 | 第14-20页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发现及作用原理 | 第14-15页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas9系统的优缺点 | 第15-16页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9系统的作用 | 第16-18页 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9系统在作物中的应用 | 第18-20页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.2.1 Cas9核酸酶活性的修饰 | 第20页 |
| 1.2.2 Cas9相关的融合蛋白 | 第20-21页 |
| 1.2.3 Cas9启动子的优化 | 第21页 |
| 1.2.4 Cas9蛋白突变体的发掘 | 第21页 |
| 1.2.5 sgRNA长度的优化 | 第21-22页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9系统基因编辑的分析 | 第22-26页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统导入植物细胞的方法 | 第22-23页 |
| 1.3.2 基因编辑的分析方法 | 第23-25页 |
| 1.3.3 靶标序列突变的特点 | 第25页 |
| 1.3.4 影响基因编辑效率和遗传的因素 | 第25-26页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9基因编辑技术应用展望 | 第26-27页 |
| 1.5 GhCLA1和GhVP基因的研究进展 | 第27页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第27-28页 |
| 2 材料和方法 | 第28-39页 |
| 2.1 实验材料和试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第28页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第28-29页 |
| 2.2 GhCLA1和GhVP基因的表达情况检测 | 第29-30页 |
| 2.2.1 棉花叶片总RNA的提取及反转录 | 第29页 |
| 2.2.2 GhCLA1和GhVP基因的半定量PCR检测 | 第29-30页 |
| 2.3 GhCLA1和GhVP基因sgRNA的设计 | 第30页 |
| 2.4 CRISPR/Cas9系统植物表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.4.1 CRISPR/Cas9系统植物表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.4.2 CRISPR/Cas9系统表达载体农杆菌的转化 | 第31页 |
| 2.5 棉花子叶原生质体的提取及转化 | 第31-33页 |
| 2.5.1 棉花子叶原生质体的提取及转化 | 第31-32页 |
| 2.5.2 棉花子叶原生质体DNA的提取 | 第32-33页 |
| 2.6 农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化 | 第33-35页 |
| 2.6.1 农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化 | 第33-35页 |
| 2.6.2 转基因棉花植株的PCR检测 | 第35页 |
| 2.7 基因编辑结果的检测 | 第35-36页 |
| 2.7.1 棉花原生质体基因编辑情况的检测 | 第35-36页 |
| 2.7.2 转基因棉花植株基因编辑情况的检测 | 第36页 |
| 2.8 CRISPR/Cas9系统在转基因棉花中脱靶情况的检测 | 第36页 |
| 2.9 棉花U6启动子的克隆及载体构建 | 第36-38页 |
| 2.9.1 棉花U6启动子的克隆 | 第36-37页 |
| 2.9.2 棉花特异性CRISPR/Cas9系统表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.10 Cas9-sgRNA复合体（RNP）的获得及应用 | 第38-39页 |
| 2.10.1 sgRNA的体外转录 | 第38页 |
| 2.10.2 RNP复合体的体外切割实验 | 第38-39页 |
| 2.10.3 RNP复合体的原生质体转化 | 第39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-58页 |
| 3.1 GhCLA1和GhVP基因的表达情况检测 | 第39-40页 |
| 3.2 GhCLA1和GhVP基因sgRNA的设计 | 第40-42页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9系统植物表达载体的构建 | 第42-44页 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas9系统植物表达载体的构建过程 | 第42-43页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9系统植物表达载体的酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 3.4 棉花子叶原生质体基因编辑的检测 | 第44-47页 |
| 3.4.1 棉花子叶原生质体的完整性检测 | 第44-45页 |
| 3.4.2 棉花子叶原生质体遗传转化效果的检测 | 第45页 |
| 3.4.3 棉花子叶原生质体基因编辑的检测 | 第45-47页 |
| 3.5 转基因棉花植株中基因编辑的检测 | 第47-49页 |
| 3.6 CRISPR/Cas9系统在转基因棉花植株中脱靶情况的检测 | 第49-54页 |
| 3.7 陆地棉U6启动子的克隆及功能验证 | 第54-57页 |
| 3.7.1 陆地棉U6启动子的克隆 | 第54-55页 |
| 3.7.2 棉花特异性CRISPR/Cas9系统表达载体的构建 | 第55-56页 |
| 3.7.3 陆地棉U6启动子的功能验证 | 第56-57页 |
| 3.8 Cas9-sgRNA复合体（RNP）体外和体内基因编辑的检测 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-66页 |
| 4.1 影响CRISPR/Cas9系统在棉花中应用的因素 | 第58-63页 |
| 4.1.1 CRISPR/Cas9系统介导的棉花基因编辑 | 第58-59页 |
| 4.1.2 CRISPR/Cas9系统编辑棉花基因的效率和特异性 | 第59-60页 |
| 4.1.3 影响棉花转基因效率的因素 | 第60-61页 |
| 4.1.4 在棉花中更好地应用CRISPR/Cas9系统 | 第61-63页 |
| 4.2 CRISPR/Cas9系统在棉花中的应用前景 | 第63-66页 |
| 4.2.1 利用CRISPR/Cas9系统研究棉花基因功能 | 第63页 |
| 4.2.2 利用CRISPR/Cas9系统培育棉花新品种 | 第63-64页 |
| 4.2.3 CRISPR/Cas9系统介导的棉花表观遗传学研究 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 附录A. 棉花子叶原生质体转化相关试剂 | 第74-75页 |
| 附录B. 农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化相关试剂 | 第75-76页 |
| 附录C. 陆地棉U6启动子的克隆引物 | 第76-77页 |
| 附录D. 合成的棉花GhCas9基因序列 | 第77-79页 |
| 附录E. 棉花特异性CRISPR/Cas9系统植物表达载体构建引物 | 第79-80页 |
| 附录F. 作者简介及在读期间发表的文章 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
