| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 符号说明 | 第14-15页 |
| 第一章 综述 | 第15-43页 |
| 1. 研究现状 | 第15页 |
| 2. 肿瘤抑制因子Sall2及其相关癌症 | 第15-21页 |
| 2.1 SALL家族的成员 | 第15-16页 |
| 2.2 多瘤病毒大T抗原结合蛋白 | 第16-17页 |
| 2.3 SALL2的下游靶基因 | 第17-18页 |
| 2.4 SALL2与癌基因 | 第18-19页 |
| 2.5 SALL2和人类卵巢癌 | 第19-21页 |
| 3. 肿瘤抑制因子p16的调节机制及其相关癌症 | 第21-37页 |
| 3.1 p16的基本生化特性 | 第22-25页 |
| 3.2 p16 DNA水平的调控 | 第25-28页 |
| 3.3 p16转录水平的调节 | 第28-32页 |
| 3.4 转录后调控 | 第32-36页 |
| 3.5 p16调控和肿瘤 | 第36-37页 |
| 4.Sp转录因子及其功能 | 第37-39页 |
| 4.1 Sp转录因子家族 | 第37-38页 |
| 4.2 sp1转录因子 | 第38-39页 |
| 5.肿瘤相关蛋白AGR2及其相关癌症 | 第39-40页 |
| 5.1 AGR2的简介 | 第39-40页 |
| 5.2 AGR2促进肿瘤的生长其机制与p16相关 | 第40页 |
| 6.研究内容和意义 | 第40-41页 |
| 7.项目研究路线 | 第41-43页 |
| 第二章 实验材料 | 第43-54页 |
| 1. 材料 | 第43-54页 |
| 1.1 细胞、质粒、菌株和蛋白 | 第43-44页 |
| 1.1.1 细胞均购自美国ATCC | 第43页 |
| 1.1.2 质粒 | 第43页 |
| 1.1.3 菌株 | 第43页 |
| 1.1.4 蛋白 | 第43-44页 |
| 1.2 实验试剂 | 第44-47页 |
| 1.3 实验仪器 | 第47-48页 |
| 1.4 试剂配制 | 第48-54页 |
| 第三章 实验方法和结果 | 第54-96页 |
| 第一部分 下游靶基因的发现和确认 | 第54-75页 |
| 1. 方法 | 第54-61页 |
| 1.1 Lipofectamine2000介导的瞬时转染 | 第54页 |
| 1.2 Trizol提取细胞中RNA | 第54-55页 |
| 1.3 基因组DNA的提取 | 第55页 |
| 1.4 切胶回收 | 第55-56页 |
| 1.5 Promega双荧光素酶系统操作步骤 | 第56-57页 |
| 1.6 提取细胞蛋白 | 第57页 |
| 1.7 Western blot实验 | 第57-58页 |
| 1.8 Sall2靶基因启动子质粒构建所需引物 | 第58-59页 |
| 1.9 扩增p16 gene region, p16 exon 1 和p16 promoter region的引物 | 第59-61页 |
| 2. 实验结果 | 第61-74页 |
| 2.1 Sall2能够上调p16的表达 | 第61-65页 |
| 2.1.1 分析SKOV3细胞中Sall2影响基因的表达情况 | 第61-62页 |
| 2.1.2 Sall2影响基因的GO（Gene Ontology）分类分析 | 第62-65页 |
| 2.2.进一步确认Sall2的下游靶基因 | 第65-68页 |
| 2.2.1 Sall2的部分下游靶基因 | 第65-66页 |
| 2.2.2 靶基因启动子质粒构建 | 第66页 |
| 2.2.3 Sall2的两个亚型都能通过调节启动子活性来调控下游靶基因的表达 | 第66-68页 |
| 2.3 验证SKOV3细胞中p16的转录情况 | 第68-73页 |
| 2.3.1 p16 gene region，p16 exon 1 和p16 promoter region PCR扩增结果 | 第69页 |
| 2.3.2 扩增p16 gene region，exon1和promoter region结果分析 | 第69-70页 |
| 2.3.3 不同细胞系中p16序列比对 | 第70-73页 |
| 2.4 Sall2上调p16的表达并呈剂量依赖性 | 第73-74页 |
| 2.4.1 Sall2上调p16的表达 | 第73-74页 |
| 2.4.2 Sall2对p16的上调呈剂量依赖性 | 第74页 |
| 3. 小结 | 第74-75页 |
| 第二部分 Sall2调节p16启动子的研究 | 第75-88页 |
| 1. 方法 | 第75-80页 |
| 1.1 Lipofectamine2000介导的瞬时转染 | 第75页 |
| 1.2 切胶回收 | 第75页 |
| 1.3 突变 | 第75-77页 |
| 1.3.1 Inverse PCR | 第75-76页 |
| 1.3.2 Dpn I消化模版 | 第76页 |
| 1.3.3 连接 | 第76-77页 |
| 1.3.4 转化 | 第77页 |
| 1.4 Promega双荧光素酶系统操作步骤 | 第77页 |
| 1.5 扩增入p16启动子（p16-pr）的巢氏PCR引物和条件 | 第77-78页 |
| 1.6 p GL3-Basic-p16-pr质粒构建 | 第78-79页 |
| 1.7 p16-Luc缺失突变质粒构建引物 | 第79-80页 |
| 1.8 Sall2缺失突变质粒构建引物 | 第80页 |
| 2. 实验结果 | 第80-87页 |
| 2.1 Sall2可结合于p16的启动子近端位点并诱导p16启动子的活性 | 第80-86页 |
| 2.1.1 p16-Luc质粒构建 | 第80-82页 |
| 2.1.2 p16-Luc缺失突变质粒构建 | 第82-83页 |
| 2.1.3 结合位点初步分析 | 第83-84页 |
| 2.1.4 p16-Luc进一步缺失突变 | 第84-85页 |
| 2.1.5 Sall2结合于p16的启动子近端位点的确定 | 第85-86页 |
| 2.2 Sall2的第3个锌指结构对p16启动子活性起到决定性作用 | 第86-87页 |
| 2.2.1 Sall2缺失突变质粒构建 | 第86-87页 |
| 2.2.2 Sall2的第3个锌指结构对上调p16启动子活性起到决定性作用 | 第87页 |
| 3. 小结 | 第87-88页 |
| 第三部分：Sall2对p16调节的生物学功能 | 第88-95页 |
| 1. 方法 | 第88-91页 |
| 1.1 p16 minigene的构建 | 第88页 |
| 1.2 Lipofectamine2000介导的瞬时转染 | 第88页 |
| 1.3 p16的si RNA | 第88-89页 |
| 1.4 Lipofectamine RNAi MAX介导的瞬时转染 | 第89页 |
| 1.5 提取细胞蛋白 | 第89页 |
| 1.6 Western blot实验 | 第89-90页 |
| 1.7 流式细胞检测 | 第90-91页 |
| 2. 实验结果 | 第91-95页 |
| 2.1 Sall2对p16的诱导表达可引起细胞周期的阻滞 | 第91-93页 |
| 2.1.1 p16 minigene的构建 | 第91页 |
| 2.1.2 Sall2通过诱导p16表达抑制细胞周期 | 第91-93页 |
| 2.2 敲降p16后Sall2抑制细胞周期作用显著减弱 | 第93-95页 |
| 2.2.1 p16RNAi | 第93页 |
| 2.2.2 敲降p16后Sall2抑制细胞周期的能力降低 | 第93-95页 |
| 3. 小结 | 第95页 |
| 第四部分 实验结果总结 | 第95-96页 |
| 第四章 讨论和展望 | 第96-100页 |
| 参考文献 | 第100-116页 |
| 附录1 英文缩略语 | 第116-118页 |
| 附录2 质粒序列 | 第118-128页 |
| 1. pGL3 Basic p16 promoter Vector | 第118-123页 |
| 2. p16 minigene | 第123-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
| 攻读博士学位期间发表或待发表的学术论文及专利 | 第129-130页 |
