| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略词 | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-31页 |
| 1 稻纵卷叶螟 | 第14-16页 |
| 2 昆虫几丁质合成酶和几丁质合成酶基因 | 第16-17页 |
| 3 RNAi的研究进展及应用 | 第17-21页 |
| 3.1 RNAi的研究进展 | 第17-20页 |
| 3.2 RNAi在害虫生物防治中的应用 | 第20-21页 |
| 4 植物转基因技术及其应用 | 第21-28页 |
| 4.1 植物转基因技术 | 第21-26页 |
| 4.2 植物转基因技术的应用 | 第26-28页 |
| 5 研究目的及意义 | 第28-30页 |
| 5.1 研究目的 | 第28页 |
| 5.2 研究意义 | 第28-30页 |
| 6 本研究采取的技术路线 | 第30-31页 |
| 第二章 稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的克隆、序列分析及mRNA表达分析 | 第31-69页 |
| 1 实验材料 | 第32-35页 |
| 1.1 供试昆虫及取样 | 第32页 |
| 1.2 主要试剂与耗材 | 第32-33页 |
| 1.2.1 Amp溶液的配制 | 第33页 |
| 1.2.2 X-gal溶液的配制 | 第33页 |
| 1.2.3 IPTG溶液的配制 | 第33页 |
| 1.3 主要仪器 | 第33-34页 |
| 1.4 大肠杆菌培养基（LB） | 第34-35页 |
| 1.4.1 液体LB培养基 | 第34页 |
| 1.4.2 固体LB培养基 | 第34-35页 |
| 2 实验方法 | 第35-47页 |
| 2.1 稻纵卷叶螟总RNA的抽提 | 第35-36页 |
| 2.2 第一链cDNA合成 | 第36-38页 |
| 2.2.1 用于RT-PCR第一链cDNA合成 | 第36-37页 |
| 2.2.2 用于 3' RACE-PCR第一链cDNA合成 | 第37-38页 |
| 2.3 CmCHSA基因片段的克隆 | 第38-43页 |
| 2.3.1 RT-PCR反应 | 第38-39页 |
| 2.3.2 目的片段的回收 | 第39-40页 |
| 2.3.3 目的片段的连接 | 第40-41页 |
| 2.3.4 连接产物的转化及鉴定 | 第41-43页 |
| 2.4 CmCHSA基因的 3'RACE-PCR扩增 | 第43-44页 |
| 2.5 CmCHSA基因的生物信息学分析 | 第44-45页 |
| 2.6 CmCHSA基因时空表达的相对RT-qPCR分析 | 第45-47页 |
| 2.7 数据统计与分析 | 第47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-66页 |
| 3.1 稻纵卷叶螟总RNA的提取 | 第47-48页 |
| 3.2 CmCHSA基因的克隆和序列分析 | 第48-54页 |
| 3.3 CmCHSA蛋白序列比对和系统进化树构建 | 第54-60页 |
| 3.4 CmCHSA蛋白结构分析 | 第60-62页 |
| 3.5 CmCHSA基因的时空表达分析 | 第62-66页 |
| 4 讨论 | 第66-69页 |
| 第三章 注射双链RNA干扰稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的表达 | 第69-92页 |
| 1 实验材料 | 第70-71页 |
| 1.1 供试昆虫 | 第70页 |
| 1.2 主要试剂与耗材 | 第70-71页 |
| 1.3 主要仪器 | 第71页 |
| 2 方法 | 第71-81页 |
| 2.1 靶位点设计与合成 | 第71-72页 |
| 2.2 合成dsRNA的引物设计 | 第72-73页 |
| 2.3 dsRNA的合成 | 第73-79页 |
| 2.3.1 高浓度模板的制备 | 第73-76页 |
| 2.3.2 dsRNA的合成及纯化 | 第76-79页 |
| 2.4 显微注射 | 第79页 |
| 2.5 RNAi沉默效应检测 | 第79-81页 |
| 2.5.1 取食情况观察 | 第79页 |
| 2.5.2 虫体表型的观察 | 第79页 |
| 2.5.3 定量PCR检测沉默效应 | 第79-80页 |
| 2.5.4 死亡率与校正死亡率的统计 | 第80-81页 |
| 2.5.5 数据统计与分析 | 第81页 |
| 3 结果与分析 | 第81-89页 |
| 3.1 dsRNA的合成 | 第81-84页 |
| 3.1.1 靶位点的克隆验证 | 第81-82页 |
| 3.1.2 高浓度模板的获得 | 第82-83页 |
| 3.1.3 dsRNA的合成 | 第83-84页 |
| 3.2 RNAi效应检测 | 第84-89页 |
| 3.2.1 取食情况观察 | 第84-86页 |
| 3.2.2 注射dsRNA对稻纵卷叶螟表型的影响 | 第86-88页 |
| 3.2.3 Cm CHSA基因的表达分析 | 第88-89页 |
| 3.2.4 死亡率与校正死亡率 | 第89页 |
| 4 讨论 | 第89-92页 |
| 第四章 重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定 | 第92-112页 |
| 1 实验材料 | 第92-94页 |
| 1.1 质粒、菌株 | 第92-93页 |
| 1.2 酶、试剂盒及引物 | 第93页 |
| 1.3 主要仪器 | 第93页 |
| 1.4 培养基 | 第93-94页 |
| 1.4.1 大肠杆菌培养基（LB） | 第94页 |
| 1.4.2 农杆菌培养基（YEB） | 第94页 |
| 2 方法 | 第94-104页 |
| 2.1 靶位点合成 | 第94-96页 |
| 2.2 质粒的提取 | 第96-97页 |
| 2.3 质粒的酶切回收 | 第97-98页 |
| 2.3.1 pUC57-CmCHSA-Ⅰ*和pUC57-CmCHSA-Ⅱ*的双酶切 | 第97-98页 |
| 2.3.2 p1301质粒的双酶切 | 第98页 |
| 2.3.3 目的片段的回收 | 第98页 |
| 2.4 重组表达载体的构建 | 第98-99页 |
| 2.5 重组表达载体的筛选 | 第99页 |
| 2.6 重组表达载体的鉴定 | 第99-102页 |
| 2.6.1 菌落PCR鉴定 | 第100-101页 |
| 2.6.2 双酶切检测 | 第101页 |
| 2.6.3 测序鉴定 | 第101-102页 |
| 2.7 农杆菌转化及鉴定 | 第102-104页 |
| 2.7.1 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备 | 第102页 |
| 2.7.2 重组表达载体的转化 | 第102-103页 |
| 2.7.3 重组表达载体转化根癌农杆菌的PCR鉴定 | 第103-104页 |
| 3 结果与分析 | 第104-110页 |
| 3.1 重组表达载体的构建 | 第104-106页 |
| 3.1.1 质粒的酶切回收 | 第104-105页 |
| 3.1.2 目的基因片段与p1301的连接 | 第105-106页 |
| 3.2 重组表达载体的鉴定 | 第106-108页 |
| 3.2.1 菌落PCR鉴定 | 第106-107页 |
| 3.2.2 双酶切鉴定 | 第107-108页 |
| 3.2.3 测序鉴定 | 第108页 |
| 3.3 重组表达载体转化农杆菌及鉴定 | 第108-110页 |
| 4 讨论 | 第110-112页 |
| 第五章 水稻的遗传转化及转基因植株的检测 | 第112-134页 |
| 1 材料 | 第113-116页 |
| 1.1 供试水稻品种 | 第113页 |
| 1.2 农杆菌菌种 | 第113页 |
| 1.3 主要试剂及配方 | 第113-114页 |
| 1.3.1 主要试剂 | 第113页 |
| 1.3.2 主要试剂配方 | 第113-114页 |
| 1.4 主要仪器 | 第114-115页 |
| 1.5 主要培养基 | 第115-116页 |
| 1.5.1 农杆菌培养基（YEB） | 第115页 |
| 1.5.2 转化水稻所用培养基 | 第115-116页 |
| 2 方法 | 第116-122页 |
| 2.1 农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第116-117页 |
| 2.1.1 愈伤组织诱导及继代培养 | 第116页 |
| 2.1.2 农杆菌菌液制备 | 第116-117页 |
| 2.1.3 愈伤组织的浸染及共培养 | 第117页 |
| 2.1.4 脱菌 | 第117页 |
| 2.2 抗性愈伤的继代的筛选 | 第117-118页 |
| 2.3 转基因植株再生 | 第118页 |
| 2.3.1 抗性愈伤组织的分化 | 第118页 |
| 2.3.2 生根、炼苗及移栽 | 第118页 |
| 2.4 转基因植株的检测 | 第118-120页 |
| 2.5 转基因水稻RNAi效应检测 | 第120-122页 |
| 2.5.1 接虫 | 第120页 |
| 2.5.2 取食情况观察 | 第120-121页 |
| 2.5.3 虫体表型观察 | 第121页 |
| 2.5.4 定量PCR检测沉默效应 | 第121-122页 |
| 2.5.5 死亡率与校正死亡率的统计 | 第122页 |
| 2.5.6 数据统计与分析 | 第122页 |
| 3 结果与分析 | 第122-131页 |
| 3.1 转基因植株的获得 | 第122-124页 |
| 3.2 转基因植株的RT-PCR鉴定 | 第124-125页 |
| 3.3 转基因水稻的RNAi效应检测 | 第125-131页 |
| 3.3.1 取食情况观察 | 第125-126页 |
| 3.3.2 虫体表型观察 | 第126-127页 |
| 3.3.3 Cm CHSA表达分析 | 第127-131页 |
| 3.3.4 死亡率与校正死亡率计算 | 第131页 |
| 4 讨论 | 第131-134页 |
| 第六章 结论与展望 | 第134-137页 |
| 1 结论 | 第134-135页 |
| 2 创新点 | 第135页 |
| 3 不足之处 | 第135-136页 |
| 4 展望 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-148页 |
| 附录一 | 第148-150页 |
| 附录二 | 第150-151页 |
| 附图 | 第151-152页 |
