| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文缩略表 | 第17-18页 |
| 第一章 引言 | 第18-33页 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征 | 第18页 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒 | 第18-23页 |
| 1.2.1 病毒的结构蛋白及其功能 | 第19-21页 |
| 1.2.2 病毒的非结构蛋白及其功能 | 第21-22页 |
| 1.2.3 病毒的细胞嗜性 | 第22-23页 |
| 1.3 PRRSV的免疫应答和持续性感染 | 第23-25页 |
| 1.3.1 先天性免疫和病毒持续感染 | 第23-24页 |
| 1.3.2 获得性免疫 | 第24-25页 |
| 1.3.2.1 体液免疫 | 第24-25页 |
| 1.3.2.2 细胞免疫 | 第25页 |
| 1.4 PRRSV疫苗 | 第25-28页 |
| 1.4.1 现有疫苗及问题 | 第25-26页 |
| 1.4.2 PRRSV新型疫苗 | 第26-28页 |
| 1.4.2.1 细胞因子作为免疫佐剂 | 第26-27页 |
| 1.4.2.2 化学试剂作为免疫佐剂 | 第27页 |
| 1.4.2.3 细菌代谢产物 | 第27-28页 |
| 1.5 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的功能及应用 | 第28-32页 |
| 1.5.1 GM-CSF | 第28-30页 |
| 1.5.2 GM-CSF在T细胞免疫调节中的作用 | 第30-31页 |
| 1.5.3 GM-CSF在抗肿瘤免疫中的作用 | 第31页 |
| 1.5.4 GM-CSF作为疫苗佐剂的应用 | 第31-32页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第32-33页 |
| 第二章 表达猪源GM-CSF重组PRRS病毒的构建 | 第33-51页 |
| 摘要 | 第33-34页 |
| 2.1 材料和方法 | 第34-42页 |
| 2.1.1 病毒株、细胞和载体 | 第34页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第34页 |
| 2.1.3 含有GM-CSF重组PRRSV感染性分子克隆的构建 | 第34-35页 |
| 2.1.4 pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF-TRS6和pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF质粒的构建 | 第35-38页 |
| 2.1.4.1 引物设计 | 第35-36页 |
| 2.1.4.2 利用融合PCR方法构建重组质粒的具体实施步骤 | 第36-38页 |
| 2.1.5 含有GM-CSF的重组PRRSV的拯救 | 第38-40页 |
| 2.1.5.1 重组PRRSV全长cDNA的构建 | 第38页 |
| 2.1.5.2 重组PRRSV全长cDNA的线性化 | 第38-39页 |
| 2.1.5.3 重组PRRSV线性化cDNA的体外转录 | 第39页 |
| 2.1.5.4 重组病毒基因组RNA转染至BHK-21细胞 | 第39页 |
| 2.1.5.5 重组病毒的拯救和传代 | 第39-40页 |
| 2.1.6 含有GM-CSF的重组PRRSV的鉴定 | 第40-42页 |
| 2.1.6.1 RT-PCR鉴定和DNA测序分析 | 第40-41页 |
| 2.1.6.2 重组病毒分子标记的鉴定 | 第41页 |
| 2.1.6.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第41页 |
| 2.1.6.4 Western blotting鉴定 | 第41-42页 |
| 2.1.7 含有GM-CSF的重组PRRSV的生物学特性分析 | 第42页 |
| 2.1.7.1 TCID50测定 | 第42页 |
| 2.1.7.2 病毒生长曲线绘制 | 第42页 |
| 2.1.7.3 重组病毒噬斑形成的形态分析 | 第42页 |
| 2.1.7.4 重组病毒的遗传稳定性分析 | 第42页 |
| 2.2 结果 | 第42-49页 |
| 2.2.1 重组病毒的细胞病变观察 | 第42-43页 |
| 2.2.2 重组病毒的MluI酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.3 重组病毒的RT-PCR鉴定及测序分析 | 第44-45页 |
| 2.2.4 重组病毒表达GM-CSF蛋白的IFA鉴定 | 第45页 |
| 2.2.5 重组病毒表达pGM-CSF蛋白的Western blot鉴定 | 第45-46页 |
| 2.2.6 重组病毒的生物学特性分析 | 第46-49页 |
| 2.2.6.1 重组病毒的生长滴度测定 | 第46页 |
| 2.2.6.2 重组病毒噬斑形态分析 | 第46-47页 |
| 2.2.6.3 重组病毒的生长曲线的绘制 | 第47页 |
| 2.2.6.4 重组病毒的遗传稳定性分析 | 第47-49页 |
| 2.3 讨论 | 第49-51页 |
| 第三章 表达猪源GM-CSF的缺失重组PRRS病毒的构建 | 第51-63页 |
| 摘要 | 第51-52页 |
| 3.1 材料和方法 | 第52-55页 |
| 3.1.1 病毒株、细胞和载体 | 第52页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第52页 |
| 3.1.3 含有GM-CSF的缺失重组PRRSV感染性分子克隆的构建 | 第52-53页 |
| 3.1.4 含有GM-CSF的缺失重组PRRSV的拯救 | 第53-54页 |
| 3.1.4.1 缺失重组PRRSV全长cDNA的线性化 | 第53页 |
| 3.1.4.2 缺失重组PRRSV全长线性化cDNA的体外转录和转染 | 第53-54页 |
| 3.1.4.3 缺失重组病毒的拯救和传代 | 第54页 |
| 3.1.5 含有GM-CSF的缺失重组病毒的鉴定分析 | 第54-55页 |
| 3.1.5.1 RT-PCR和DNA测序鉴定 | 第54页 |
| 3.1.5.2 缺失重组病毒分子标记酶切鉴定 | 第54页 |
| 3.1.5.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定分析 | 第54-55页 |
| 3.1.6 含有GM-CSF的缺失重组病毒生物学特性分析 | 第55页 |
| 3.1.6.1 缺失重组病毒的生长滴度测定 | 第55页 |
| 3.1.6.2 缺失重组病毒的生长曲线绘制 | 第55页 |
| 3.1.6.3 缺失重组病毒空斑形成的形态分析 | 第55页 |
| 3.1.6.4 缺失重组病毒的遗传稳定性分析 | 第55页 |
| 3.2 结果 | 第55-61页 |
| 3.2.1 缺失重组质粒全长的构建 | 第55-56页 |
| 3.2.2 缺失病毒的细胞病变观察 | 第56-57页 |
| 3.2.3 缺失病毒的分子标记酶切鉴定 | 第57页 |
| 3.2.4 RT-PCR鉴定和DNA测序分析 | 第57-58页 |
| 3.2.5 缺失病毒表达pGM-CSF蛋白的IFA鉴定 | 第58-59页 |
| 3.2.6 缺失病毒的生物学特性分析 | 第59-61页 |
| 3.2.6.1 生长滴度测定 | 第59页 |
| 3.2.6.2 病毒的生长动力学分析 | 第59-60页 |
| 3.2.6.3 病毒噬斑形态分析 | 第60页 |
| 3.2.6.4 缺失病毒的遗传稳定性分析 | 第60-61页 |
| 3.3 讨论 | 第61-63页 |
| 第四章 重组病毒体外促进骨髓源树突状细胞成熟和分化作用的研究 | 第63-77页 |
| 摘要 | 第63-64页 |
| 4.1 材料和方法 | 第64-67页 |
| 4.1.1 病毒株和细胞 | 第64页 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 | 第64页 |
| 4.1.3 猪骨髓细胞(BMHC)分离 | 第64页 |
| 4.1.4 猪骨髓源树突状细胞(BMDC)的培养 | 第64-65页 |
| 4.1.5 流式细胞术检测细胞表面分子表达 | 第65页 |
| 4.1.6 细胞因子检测 | 第65-66页 |
| 4.1.7 细胞因子mRNA水平检测 | 第66-67页 |
| 4.1.7.1 相对荧光定量PCR引物的设计 | 第66页 |
| 4.1.7.2 提取细胞总RNA | 第66页 |
| 4.1.7.3 合成cDNA | 第66-67页 |
| 4.1.7.4 实时荧光定量PCR | 第67页 |
| 4.2 结果 | 第67-74页 |
| 4.2.1 表达GM-CSF的重组PRRSV对GM-CSF蛋白预刺激的BMHC的作用 | 第67-70页 |
| 4.2.2 表达GM-CSF的重组PRRSV直接对BMHC的刺激作用 | 第70-73页 |
| 4.2.3 细胞因子检测 | 第73页 |
| 4.2.4 细胞因子mRNA水平检测 | 第73-74页 |
| 4.3 讨论 | 第74-77页 |
| 第五章 重组病毒感染猪诱导的免疫特性分析 | 第77-85页 |
| 摘要 | 第77-78页 |
| 5.1 材料与方法 | 第78-80页 |
| 5.1.1 实验动物 | 第78页 |
| 5.1.2 细胞、病毒和病毒扩增 | 第78页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第78页 |
| 5.1.4 实验分组及免疫剂量 | 第78页 |
| 5.1.5 血清中PRRSV抗体水平检测 | 第78-79页 |
| 5.1.6 血清中病毒含量的测定 | 第79页 |
| 5.1.7 流式术检测免疫细胞的活化水平 | 第79-80页 |
| 5.2 结果 | 第80-83页 |
| 5.2.1 重组病毒免疫猪后的体温变化及临床观察 | 第80页 |
| 5.2.2 猪血清中PRRSV抗体检测结果 | 第80-81页 |
| 5.2.3 猪血清中病毒含量的检测结果 | 第81-82页 |
| 5.2.4 流式术分析外周血免疫细胞的变化 | 第82-83页 |
| 5.2.5 组织病理学检测结果 | 第83页 |
| 5.3 讨论 | 第83-85页 |
| 第六章 全文结论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 作者简历 | 第101-103页 |
