| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 第1章 绪论 | 第11-27页 |
| 1.1 CRISPR-Cas系统的发展历史 | 第11-12页 |
| 1.2 CRISPR-Cas系统的结构 | 第12-14页 |
| 1.2.1 CRISPR结构 | 第13-14页 |
| 1.2.2 Cas蛋白 | 第14页 |
| 1.3 CRISPR的分类和分布 | 第14-19页 |
| 1.3.1 类型Ⅰ CRISPR-Cas系统 | 第15-16页 |
| 1.3.2 类型Ⅱ CRISPR-Cas系统 | 第16-18页 |
| 1.3.3 类型Ⅲ CRISPR-Cas系统 | 第18-19页 |
| 1.4 CRISPR-Cas系统的分子作用机制 | 第19-20页 |
| 1.5 CRISPR-Cas系统的应用 | 第20-24页 |
| 1.5.1 利用CRISPR的多样性进行基因分型 | 第20-21页 |
| 1.5.2 在产业生产中对病毒产生抗性 | 第21-22页 |
| 1.5.3 利用Cas9进行基因组编辑 | 第22-24页 |
| 1.6 待解决的问题 | 第24-27页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第27-51页 |
| 2.1 DH5a感受态的制备 | 第27-28页 |
| 2.1.1 试剂与仪器 | 第27页 |
| 2.1.2 制备方法 | 第27-28页 |
| 2.2 DH5a基因组抽提 | 第28-29页 |
| 2.2.1 试剂与仪器 | 第28页 |
| 2.2.2 基因组抽提方法 | 第28-29页 |
| 2.3 从DH5a基因组中克隆cas1/2片段 | 第29-31页 |
| 2.3.1 试剂与仪器 | 第29页 |
| 2.3.2 PCR反应系统 | 第29页 |
| 2.3.3 PCR的反应程序 | 第29-30页 |
| 2.3.4 PCR产物回收 | 第30页 |
| 2.3.5 电泳检测回收产物效率 | 第30-31页 |
| 2.4 双酶切表达质粒pET3a | 第31页 |
| 2.4.1 试剂与仪器 | 第31页 |
| 2.4.2 双酶切实验 | 第31页 |
| 2.5 连接cas1/2基因与表达质粒pET3a | 第31页 |
| 2.6 把连接产物转化到DH5a感受态 | 第31-32页 |
| 2.6.1 试剂与仪器 | 第31-32页 |
| 2.6.2 转化过程 | 第32页 |
| 2.7 抽提cas1/2-pET3a质粒 | 第32-34页 |
| 2.7.1 试剂与仪器 | 第32-33页 |
| 2.7.2 质粒抽提 | 第33-34页 |
| 2.7.3 双酶切验证重组质粒 | 第34页 |
| 2.8 选择其他表达Cas1/2的载体 | 第34页 |
| 2.9 克隆RBS-cas1/2-T7 terminator片段 | 第34-35页 |
| 2.9.1 试剂与仪器 | 第34-35页 |
| 2.9.2 PCR反应系统 | 第35页 |
| 2.9.3 PCR的程序 | 第35页 |
| 2.10 载体线性化 | 第35-36页 |
| 2.10.1 试剂与仪器 | 第35页 |
| 2.10.2 酶切反应系统 | 第35-36页 |
| 2.10.3 琼脂糖胶回收双酶切产物 | 第36页 |
| 2.10.4 电泳检测回收产物效率 | 第36页 |
| 2.11 RBS-cas1/2-T7 terminator与载体连接 | 第36页 |
| 2.12 把连接产物转化到DH5a感受态 | 第36-37页 |
| 2.12.1 试剂与仪器 | 第36页 |
| 2.12.2 转化过程 | 第36-37页 |
| 2.13 抽提重组质粒并双酶切验证 | 第37页 |
| 2.14 构建cas1/2-pCDFDuet-1 | 第37-38页 |
| 2.15 制备大肠杆菌BL21AI感受态 | 第38页 |
| 2.16 把重组载体转化到BL21AI感受态中 | 第38页 |
| 2.17 诱导cas1/2表达 | 第38-40页 |
| 2.17.1 试剂与仪器 | 第38-39页 |
| 2.17.2 诱导方法 | 第39-40页 |
| 2.18 检测间区序列的捕获效率 | 第40-41页 |
| 2.18.1 试剂与仪器 | 第40页 |
| 2.18.2 实验方法 | 第40页 |
| 2.18.3 比较重组载体捕获间区序列的效率 | 第40-41页 |
| 2.19 回收扩增的CRISPR片段并测序验证 | 第41页 |
| 2.19.1 Blast网址 | 第41页 |
| 2.19.2 回收目的片段 | 第41页 |
| 2.19.3 提取插入的新间区序列 | 第41页 |
| 2.19.4 分析间区序列 | 第41页 |
| 2.20 预实验总结 | 第41-42页 |
| 2.21 设置阴性对照 | 第42-43页 |
| 2.22 制备高通量测序样品 | 第43-44页 |
| 2.22.1 试剂与仪器 | 第43页 |
| 2.22.2 样品制备 | 第43-44页 |
| 2.23 高通量测序 | 第44-45页 |
| 2.23.1 仪器 | 第44页 |
| 2.23.2 测序过程 | 第44-45页 |
| 2.24 数据处理与分析 | 第45-51页 |
| 2.24.1 上游数据处理方法与步骤 | 第46-48页 |
| 2.24.2 下游数据处理方法与步骤 | 第48-51页 |
| 第3章 实验结果与分析 | 第51-61页 |
| 3.1 构建高效的间区序列捕获系统 | 第51-52页 |
| 3.2 AAG和CAG是主要的PAM类型 | 第52-53页 |
| 3.3 来自重组质粒的间区序列具有基因偏好性 | 第53-56页 |
| 3.4 来自基因组的间区序列比例偏高 | 第56-58页 |
| 3.5 存在规律序列单元丢失 | 第58-61页 |
| 第4章 总结与讨论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-69页 |
| 附录 | 第69-87页 |
| 致谢 | 第87-89页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第89页 |