菜豆环氧化物水解酶PvEH1的催化性质及分子改造研究
| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 环氧化物水解酶 | 第9-12页 |
| 1.1.1 EHs的结构分类 | 第9-11页 |
| 1.1.2 α/β水解折叠EHs的催化机制 | 第11页 |
| 1.1.3 EHs的应用 | 第11-12页 |
| 1.2 对映归一性酶促水解 | 第12-14页 |
| 1.2.1 单酶法 | 第12-13页 |
| 1.2.2 双酶法 | 第13-14页 |
| 1.2.3 化学-酶法 | 第14页 |
| 1.3 EHs-催化反应的工艺优化 | 第14-16页 |
| 1.3.1 EHs的分子改造 | 第14-15页 |
| 1.3.2 EHs的固定化 | 第15页 |
| 1.3.3 反应媒介的拓宽 | 第15-16页 |
| 1.4 本课题的研究意义和研究思路 | 第16-18页 |
| 1.4.1 研究意义 | 第16页 |
| 1.4.2 研究思路及内容提要 | 第16-18页 |
| 第二章 菜豆环氧化物水解酶的表达和催化性质表征 | 第18-34页 |
| 2.1 引言 | 第18页 |
| 2.2 实验材料 | 第18-20页 |
| 2.2.1 材料 | 第18页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第18-19页 |
| 2.2.3 常用溶液的配制 | 第19-20页 |
| 2.3 实验方法 | 第20-26页 |
| 2.3.1 PvEH1的基因克隆 | 第20-21页 |
| 2.3.2 PvEH1的异源表达 | 第21-23页 |
| 2.3.3 诱导表达条件优化 | 第23-24页 |
| 2.3.4 蛋白纯化 | 第24-25页 |
| 2.3.5 酶学性质分析 | 第25页 |
| 2.3.6 催化性质的分析 | 第25-26页 |
| 2.3.7 PvEH1的生物信息学分析 | 第26页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第26-34页 |
| 2.4.1 PvEH1的基因克隆及异源表达 | 第26-27页 |
| 2.4.2 诱导表达条件的优化 | 第27-28页 |
| 2.4.3 蛋白含量与酶活测定 | 第28页 |
| 2.4.4 酶学性质分析 | 第28-30页 |
| 2.4.5 PvEH1催化性质分析 | 第30-31页 |
| 2.4.6 PvEH1生物信息学分析 | 第31-34页 |
| 第三章 菜豆环氧化物水解酶的分子改造 | 第34-42页 |
| 3.1 引言 | 第34页 |
| 3.2 实验材料 | 第34-35页 |
| 3.2.1 材料 | 第34页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第34页 |
| 3.2.3 常用溶液的配制 | 第34-35页 |
| 3.3 实验方法 | 第35-37页 |
| 3.3.1 定点突变方案设计 | 第35-36页 |
| 3.3.2 定点突变的突变体基因构建 | 第36页 |
| 3.3.3 迭代饱和突变的突变文库构建 | 第36-37页 |
| 3.3.4 突变体的催化性质表征 | 第37页 |
| 3.3.5 最优突变体的纯化 | 第37页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第37-42页 |
| 3.4.1 突变位点的选择 | 第37-38页 |
| 3.4.2 单位点突变体的催化性质表征 | 第38-39页 |
| 3.4.3 多位点突变体的催化性质表征 | 第39-40页 |
| 3.4.4 迭代饱和突变 | 第40-41页 |
| 3.4.5 最优突变体的蛋白纯化 | 第41-42页 |
| 第四章 菜豆环氧化物水解酶的应用研究 | 第42-51页 |
| 4.1 引言 | 第42页 |
| 4.2 实验材料 | 第42-43页 |
| 4.2.1 材料 | 第42页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第42页 |
| 4.2.3 常用溶液的配制 | 第42-43页 |
| 4.3 实验方法 | 第43-46页 |
| 4.3.1 底物谱测定 | 第43-44页 |
| 4.3.2 单水相体系中的反应限 | 第44页 |
| 4.3.3 底物及产物浓度对酶促反应的影响 | 第44-45页 |
| 4.3.4 有机溶剂对酶促反应的影响 | 第45-46页 |
| 4.3.5 单酶法合成(R)-苯基乙二醇 | 第46页 |
| 4.4 实验结果 | 第46-51页 |
| 4.4.1 底物谱分析 | 第46-47页 |
| 4.4.2 单水相体系中的反应限 | 第47-48页 |
| 4.4.3 底物及产物浓度对酶促反应的影响 | 第48页 |
| 4.4.4 有机溶剂对催化剂稳定性的影响 | 第48-49页 |
| 4.4.5 双相与单相反应体系的比较 | 第49-50页 |
| 4.4.6 (R)-苯基乙二醇的酶法合成 | 第50-51页 |
| 主要结论和展望 | 第51-53页 |
| 主要结论 | 第51-52页 |
| 展望 | 第52-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 附录A: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第60-61页 |
| 附录B: 基因和蛋白序列 | 第61页 |
