| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 縮略词表 | 第10-11页 |
| 1.前言 | 第11-18页 |
| ·课题的提出 | 第11页 |
| ·赤霉素生物合成途径的研究进展 | 第11-14页 |
| ·赤霉素的生物合成 | 第11-12页 |
| ·赤霉素生物合成途径的关键酶 | 第12-14页 |
| ·植物细胞色素P450氧化酶(CYP450)异源表达研究进展 | 第14-15页 |
| ·植物细胞色素P450氧化酶 | 第14-15页 |
| ·P450蛋白的表达 | 第15-16页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第15页 |
| ·酵母表达系统 | 第15-16页 |
| ·本实验研究目的和内容 | 第16-18页 |
| 2.实验材料和试剂 | 第18-21页 |
| ·植物材料、菌株和质粒 | 第18页 |
| ·药品与试剂 | 第18页 |
| ·实验仪器 | 第18-19页 |
| ·相关溶液的配置 | 第19-21页 |
| 3.实验步骤 | 第21-41页 |
| ·纽荷尔脐橙CsCPR基因的克隆 | 第21-24页 |
| ·Trizol法提取RNA | 第21页 |
| ·RNA反转录cDNA | 第21-22页 |
| ·PCR扩增,产物回收,克隆及测序 | 第22-24页 |
| ·PCR扩增 | 第22-23页 |
| ·PCR产物回收 | 第23页 |
| ·TA克隆 | 第23-24页 |
| ·CsCPR基因序列特征分析 | 第24页 |
| ·CsCPR、CsKO和CsKAO酵母表达载体的构建 | 第24-27页 |
| ·载体选择和引物设计 | 第24-25页 |
| ·PCR扩增与测序 | 第25页 |
| ·酵母表达质粒的扩增 | 第25-26页 |
| ·质粒的提取 | 第26页 |
| ·质粒DNA的酶切 | 第26-27页 |
| ·酶切产物的回收与连接 | 第27页 |
| ·转化及重组子鉴定 | 第27页 |
| ·毕赤酵母的转化与转化方法的优化 | 第27-32页 |
| ·毕赤酵母单转化子转化方法的选择 | 第27-30页 |
| ·毕赤酵母X-33生长曲线的确定 | 第27-28页 |
| ·毕赤酵母电转化感受态的制备 | 第28页 |
| ·质粒的线性化和纯化 | 第28-29页 |
| ·线性化载体的电转化 | 第29页 |
| ·PCR验证单菌落阳性 | 第29-30页 |
| ·毕赤酵母双转化子转化方法的选择 | 第30-32页 |
| ·相同抗性载体双转化子转化方法的选择 | 第30-31页 |
| ·不同抗性载体双转化子转化方法的选择 | 第31-32页 |
| ·PPICZA/CsKO单转化子毕赤酵母感受态的制备 | 第31页 |
| ·LiCl化学转化法 | 第31-32页 |
| ·PCR验证双转化单菌落阳性 | 第32页 |
| ·毕赤酵母的表达与表达条件的优化 | 第32-34页 |
| ·不同培养时间对蛋白表达的影响 | 第32页 |
| ·不同pH对蛋白表达的影响 | 第32页 |
| ·不同甲醇浓度对蛋白表达的影响 | 第32页 |
| ·其它影响条件的正交实验设计 | 第32-33页 |
| ·蛋白总含量的测定 | 第33-34页 |
| ·粗酶液和酵母微粒体的制备 | 第33页 |
| ·总蛋白含量测定 | 第33-34页 |
| ·P450氧化酶含量测定 | 第34页 |
| ·NADPH-细胞色素cP450还原酶CsCPR的表达、纯化和酶活鉴定 | 第34-37页 |
| ·CsCPR酶的表达 | 第34页 |
| ·CsCPR酶的纯化 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第35-36页 |
| ·免疫印迹检测 | 第36-37页 |
| ·CsCPR酶的活性鉴定 | 第37页 |
| ·P450氧化酶的表达和表达产物与底物的酶促反应 | 第37-41页 |
| ·培养对象和培养方法 | 第37-38页 |
| ·蛋白粗酶液的蛋白质免疫印迹检测 | 第38页 |
| ·酶促反应底物的提取 | 第38页 |
| ·P450单氧化酶与底物的反应 | 第38-41页 |
| 4.结果与分析 | 第41-56页 |
| ·CsCPR的克隆 | 第41-42页 |
| ·RNA的提取 | 第41页 |
| ·CsCPR基因的克隆和序列分析 | 第41-42页 |
| ·CsCPR、CsKO和CsKAO酵母表达载体的构建 | 第42-43页 |
| ·毕赤酵母的单转化和双转化 | 第43-45页 |
| ·酵母表达载体的单转化 | 第43-44页 |
| ·酵母表达载体的双转化 | 第44-45页 |
| ·毕赤酵母表达条件的优化 | 第45-49页 |
| ·CO还原示差法检测CsKO的含量 | 第46-47页 |
| ·不同pH对蛋白表达的影响 | 第47页 |
| ·不同甲醇终浓度对蛋白表达的影响 | 第47-48页 |
| ·诱导表达时间对蛋白表达的影响 | 第48页 |
| ·正交试验分析 | 第48-49页 |
| ·纽荷尔脐橙NADPH-细胞色素c还原酶CsCPR的纯化和酶活鉴定 | 第49-51页 |
| ·CsCPR的纯化 | 第49-50页 |
| ·CsCPR的免疫印迹分析 | 第50-51页 |
| ·CsCPR的酶活鉴定 | 第51页 |
| ·P450单氧化酶的表达和活性鉴定 | 第51-56页 |
| ·P450单氧化酶的免疫印迹分析 | 第51-52页 |
| ·日本柳杉挥发物GC-MS检测 | 第52-53页 |
| ·GC-MS检测P450蛋白酶活 | 第53-56页 |
| 5.讨论 | 第56-59页 |
| ·P450单氧化酶和NADPH细胞色素c还原酶基因共表达方法的分析 | 第56页 |
| ·毕赤酵母表达P450单氧化酶条件优化的分析 | 第56-57页 |
| ·CsKO和CsKAO酶活鉴定的分析和本研究在柑橘上的应用 | 第57页 |
| ·柑橘赤霉素生物合成途径相关酶研究前景分析 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-68页 |
| 附录 | 第68-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
