| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 缩略语及中英文全称对照表 | 第14-16页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-41页 |
| 第一节 酿酒酵母胞内囊泡运输的研究进展 | 第17-28页 |
| 一 囊泡运输调控的分子机制 | 第17-23页 |
| 二 Golgi体为中心的囊泡系统与囊泡运输 | 第23-24页 |
| 三 囊泡运输的研究方法 | 第24-25页 |
| 四 囊泡运输障碍与生物疾病 | 第25页 |
| 五 胞内物质运输的其他模型 | 第25-28页 |
| 第二节 酿酒酵母中细胞自噬的研究进展 | 第28-39页 |
| 一 酿酒酵母中细胞自噬的分子机制 | 第28-35页 |
| 二 参与囊泡运输的因子在细胞自噬中的作用研究 | 第35-36页 |
| 三 酵母中研究细胞自噬的主要手段 | 第36-37页 |
| 四 细胞自噬与生物疾病 | 第37-39页 |
| 第三节 本研究的目的和内容 | 第39-41页 |
| 第二章 TRAPP复合体中Trs65和Trs85亚基在囊泡运输和细胞自噬过程中的作用研究 | 第41-83页 |
| 摘要 | 第41-43页 |
| 第—节 酿酒酵母中Trs65和Trs85亚基对胞内物质运输的影响 | 第43-54页 |
| 1 材料与方法 | 第43-46页 |
| ·试验材料 | 第43页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第43-44页 |
| ·酵母交配和四分体分离 | 第44页 |
| ·模板DNA的提取 | 第44-45页 |
| ·质粒的提取 | 第45页 |
| ·引物设计 | 第45页 |
| ·扩增trs65::HYG和trs85::KAN目的片段 | 第45页 |
| ·目的基因的敲除 | 第45-46页 |
| ·外源基因转化 | 第46页 |
| ·生长及液泡表型的检测 | 第46页 |
| 2 结果与分析 | 第46-53页 |
| ·TRS85敲除影响Sncl在胞内的运输 | 第46-47页 |
| ·TRS65和TRS85双敲除菌株表现强烈的高温敏感性 | 第47-49页 |
| ·TRS65和TRS85敲除对Snc1运输的影响 | 第49-51页 |
| ·TRS65和TRS85敲除对液泡形态的影响 | 第51页 |
| ·TRS65和TRS85敲除菌株缺陷表型的抑制试验 | 第51-53页 |
| 3 小结 | 第53-54页 |
| 第二节 酿酒酵母Trs65和Trs85缺失突变体中物质运输受阻部位的研究 | 第54-62页 |
| 1 材料与方法 | 第54-56页 |
| ·试验材料 | 第54页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第54页 |
| ·GFP-SNC1-PEM菌株的获得 | 第54-55页 |
| ·HTB1-CFP整合菌株的获得 | 第55页 |
| ·pRS313-VPS10-GFP转化菌株的获得 | 第55页 |
| ·SEC7-DsRed整合菌株的获得 | 第55-56页 |
| ·电镜样品的制备及电镜观察 | 第56页 |
| ·荧光显微镜观察 | 第56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-61页 |
| ·trs85Δts和trs65Δtrs85Δts突变体细胞中Snc1在反式高尔基体的堆积情况 | 第56-57页 |
| ·trs85Δts和trs65Δtrs85Δts突变体细胞中GFP-Snc1-PEM的运输情况 | 第57-58页 |
| ·trs85Δts和trs65Δtrs85Δts突变体细胞的内吞情况 | 第58-60页 |
| ·trs85Δts和trs65Δtrs85Δts突变体细胞中ER处蛋白的堆积情况 | 第60页 |
| ·电镜观察trs85Δts和trs65Δ trs85Δts突变体的胞内变化 | 第60-61页 |
| 3 小结 | 第61-62页 |
| 第三节 TRAPP复合体亚基与小G蛋白Ypts分组调控液泡的形态 | 第62-70页 |
| 1 材料与方法 | 第62-63页 |
| ·试验材料 | 第62页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第62-63页 |
| ·质粒的构建及转化 | 第63页 |
| ·生长及液泡表型的检测 | 第63页 |
| 2 结果与分析 | 第63-69页 |
| ·Trs130与Ypt31/32的作用关系 | 第63-64页 |
| ·Trs85与Ypt1的作用关系 | 第64-65页 |
| ·Trs85和Trs130的互作关系 | 第65-67页 |
| ·Ypt1和Ypt31与Trs85和Trs130的作用关系 | 第67-69页 |
| 3 小结 | 第69-70页 |
| 第四节 酿酒酵母中Trs65和Trs85亚基在细胞自噬中的功能研究 | 第70-81页 |
| 1 材料与方法 | 第70-72页 |
| ·试验材料 | 第70页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第70页 |
| ·GFP-ATG8整合菌株的获得 | 第70页 |
| ·细胞的培养和自噬的诱导 | 第70-71页 |
| ·荧光观察 | 第71页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第71页 |
| ·Western blot | 第71-72页 |
| 2 结果与分析 | 第72-80页 |
| ·trs65Δ trs85Δts突变体细胞中自噬受到了严重的影响 | 第72-74页 |
| ·Trs65和Trs85参与饥饿等逆境处理将囊泡运输的货物运送到液泡中降解的过程 | 第74-75页 |
| ·Trs85或Trs65和Trs85参与饥饿处理将细胞膜定位的蛋白运送到液泡中降解的过程 | 第75-78页 |
| ·Trs85或Trs65和Trs85参与饥饿等胁迫处理细胞液泡的融合 | 第78-80页 |
| 3 小结 | 第80-81页 |
| 第五节 本章小结 | 第81-83页 |
| 第三章 TRAPP复合体中Bet3亚基在细胞自噬中的功能初步研究 | 第83-113页 |
| 摘要 | 第83-85页 |
| 第一节 酿酒酵母Bet3亚基参与细胞自噬的研究 | 第85-94页 |
| 1 材料与方法 | 第85-88页 |
| ·试验材料 | 第85页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第85页 |
| ·细胞的培养和巨自噬的诱导 | 第85-86页 |
| ·CPY-GFP整合菌株的培养及GFP荧光的诱导观察 | 第86页 |
| ·GFP-ATG8或/和RFP-APE1整合菌株的获得 | 第86-87页 |
| ·CPY-GFP整合菌株的获得 | 第87页 |
| ·荧光观察 | 第87页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第87页 |
| ·Western blot | 第87页 |
| ·BET3的克隆及bet3ts的基因回补验证 | 第87-88页 |
| 2 结果与分析 | 第88-92页 |
| ·Bet3参与了酵母细胞羧肽酶向液泡的运输 | 第88-89页 |
| ·Bet3参与了酵母细胞的巨自噬过程 | 第89-90页 |
| ·Bet3参与了酵母细胞的Cvt途径 | 第90-92页 |
| ·bet3ts的回补验证 | 第92页 |
| 3 小结 | 第92-94页 |
| 第二节 酿酒酵母Bet3亚基突变对自噬体形成相关蛋白Atg8和Atg9定位的影响研究 | 第94-106页 |
| 1 材料与方法 | 第94-98页 |
| ·试验材料 | 第94页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第94页 |
| ·GFP-ATG8或/和RFP-APE1整合菌株的获得 | 第94页 |
| ·ATG9-3×GFP.PG5整合菌株的获得 | 第94-95页 |
| ·ATG1敲除菌株的获得 | 第95-96页 |
| ·TAKA分析 | 第96页 |
| ·细胞的培养 | 第96页 |
| ·Atg8或Atg9与Ape1共定位情况分析 | 第96-97页 |
| ·荧光照片亮度及尺寸的测量 | 第97页 |
| ·蛋白酶保护试验 | 第97-98页 |
| 2 结果与分析 | 第98-105页 |
| ·ATG1敲除菌株的获得 | 第98-99页 |
| ·Bet3突变影响Atg8向PAS的募集 | 第99-102页 |
| ·Bet3突变影响Atg9的正常循环 | 第102-104页 |
| ·Bet3突变影响自噬体的形成 | 第104-105页 |
| 3 小结 | 第105-106页 |
| 第三节 Rab/Ypt类小G蛋白对Bet3亚基突变引起自噬缺陷的抑制作用研究 | 第106-112页 |
| 1 材料与方法 | 第106-107页 |
| ·试验材料 | 第106页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第106页 |
| ·GFP-ATG8或/和RFP-APE1整合菌株的获得 | 第106-107页 |
| ·细胞的培养 | 第107页 |
| ·质粒转化 | 第107页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第107页 |
| ·Western blot | 第107页 |
| 2 结果与分析 | 第107-111页 |
| ·营养丰富条件下Ypt1和Ypt31对bet3ts突变体Cvt途径缺陷没有明显改善 | 第107-108页 |
| ·缺氮条件下Ypt1部分抑制bet3ts突变体巨自噬缺陷 | 第108-109页 |
| ·GTP形态的Ypt31对bet3ts突变体的自噬缺陷没有抑制作用 | 第109-110页 |
| ·Ypt1和Ypt31共同改善bet3ts突变体巨自噬缺陷 | 第110-111页 |
| 3 小结 | 第111-112页 |
| 第四节 本章小结 | 第112-113页 |
| 第四章 全文讨论 | 第113-117页 |
| 第五章 全文总结 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-137页 |
| 附录 | 第137-151页 |
| 攻读学位期间发表与待发表的论文 | 第151-153页 |
| 致谢 | 第153页 |
