| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-40页 |
| ·单碳化合物与甲醇 | 第17-19页 |
| ·甲基营养菌及其应用 | 第19-21页 |
| ·甲基营养杆菌及其相关基因研究进展 | 第21-28页 |
| ·甲基营养细菌的遗传操作 | 第23页 |
| ·丝氨酸乙醛酸氨基转移酶基因(sgα) | 第23-24页 |
| ·羟基丙酮酸还原酶基因(hpr) | 第24-25页 |
| ·丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA) | 第25-28页 |
| ·L—丝氨酸及其生产现状 | 第28-32页 |
| ·蛋白质水解法 | 第28-29页 |
| ·化学法 | 第29页 |
| ·发酵法 | 第29-30页 |
| ·酶法制备L—丝氨酸 | 第30页 |
| ·微生物的静息细胞体系生产L-丝氨酸 | 第30-32页 |
| ·乙醛酸及其生产现状 | 第32-36页 |
| ·化学合成法 | 第33-34页 |
| ·生物合成法 | 第34-35页 |
| ·微生物合成法与化学合成法比较 | 第35-36页 |
| ·固定化细胞技术 | 第36-39页 |
| ·固定化细胞技术的特点 | 第36-37页 |
| ·固定化细胞的方法 | 第37-39页 |
| ·本研究的目的与意义 | 第39-40页 |
| 第二章 材料与方法 | 第40-75页 |
| ·菌株及质粒 | 第40-41页 |
| ·培养基及生长条件 | 第41-44页 |
| ·培养基 | 第41-43页 |
| ·生长条件 | 第43页 |
| ·菌种保存 | 第43-44页 |
| ·抗生素 | 第44页 |
| ·溶液、缓冲液和试剂 | 第44-46页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第46-49页 |
| ·碱变性法提取质粒DNA | 第46页 |
| ·大量制备质粒DNA | 第46-47页 |
| ·试剂盒大量提质粒 | 第47页 |
| ·试剂盒快速小量提取质粒 | 第47-48页 |
| ·分光光度法测定DNA浓度 | 第48-49页 |
| ·甲基营养杆菌总DNA的提取 | 第49-50页 |
| ·快速提取 | 第49页 |
| ·甲基利用菌总DNA的大量提取 | 第49-50页 |
| ·琼脂糖电泳 | 第50-51页 |
| ·DNA酶切 | 第51页 |
| ·DNA的限制性内切酶酶切 | 第51页 |
| ·酶切DNA片段的CIP处理 | 第51页 |
| ·DNA酶切片段的分离与回收 | 第51-53页 |
| ·从低熔点胶中回收DNA片段 | 第51-52页 |
| ·透析袋电泳法分离回收DNA片段 | 第52-53页 |
| ·试剂盒法回收DNA片段 | 第53页 |
| ·DNA的连接 | 第53-55页 |
| ·载体质粒DNA的去磷酸化 | 第53-54页 |
| ·DNA连接 | 第54-55页 |
| ·质粒DNA的转化 | 第55-56页 |
| ·快速制备E.coli的感受态细胞 | 第55-56页 |
| ·转化反应 | 第56页 |
| ·丝氨酸羟甲基转移酶基因glyA的克隆与表达 | 第56-63页 |
| ·探针的制备 | 第56-57页 |
| ·DNA—DNA杂交 | 第57-60页 |
| ·构建部分基因组文库 | 第60-61页 |
| ·菌落原位杂交 | 第61页 |
| ·基因的序列分析 | 第61页 |
| ·丝氨酸羟甲基转移酶基因glyA在大肠杆菌中的表达 | 第61-62页 |
| ·重组蛋白SHMT的纯化 | 第62-63页 |
| ·羟基丙酮酸还原酶基因hpr的克隆与表达 | 第63-64页 |
| ·Bradford蛋白浓度测定方法 | 第64-65页 |
| ·SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第65-66页 |
| ·SDS-PAGE蛋白质电泳所需的溶液和试剂 | 第65-66页 |
| ·SDS-PAGE电泳过程 | 第66页 |
| ·丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)活性的测定 | 第66-69页 |
| ·SHMT逆向酶活测定的原理 | 第66页 |
| ·苯甲醛标准曲线 | 第66-67页 |
| ·SHMT酶活的测定 | 第67-68页 |
| ·HPR的酶活测定 | 第68-69页 |
| ·三亲本接合 | 第69页 |
| ·突变体的构建与互补 | 第69-70页 |
| ·突变体MB200gTB的构建 | 第69-70页 |
| ·突变体MB200hTB的构建 | 第70页 |
| ·突变体的互补 | 第70页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第70页 |
| ·菌株生长情况的分析 | 第70-71页 |
| ·菌株在不同碳源下的生长 | 第70-71页 |
| ·菌株生长曲线的测定 | 第71页 |
| ·甲基营养型细菌静息细胞反应体系 | 第71页 |
| ·L-丝氨酸的定量、定性分析 | 第71-73页 |
| ·纸层析 | 第71-72页 |
| ·DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析 | 第72-73页 |
| ·氨基酸定量分析 | 第73页 |
| ·乙醛酸含量检测 | 第73页 |
| ·固定化细胞产L-丝氨酸 | 第73-74页 |
| ·细胞的固定化 | 第73-74页 |
| ·固定化细胞反应 | 第74页 |
| ·数据统计 | 第74-75页 |
| 第三章 丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)的克隆及在大肠杆菌中的表达 | 第75-86页 |
| ·glyA基因的克隆 | 第75-81页 |
| ·MB200总DNA的提取 | 第75-76页 |
| ·探针的获得 | 第76页 |
| ·探针Southern杂交验证 | 第76-77页 |
| ·部分基因文库的构建 | 第77-79页 |
| ·阳性克隆测序与序列分析 | 第79-81页 |
| ·glyA基因在大肠杆菌中的表达 | 第81-83页 |
| ·SHMT的酶学性质初步鉴定 | 第83-85页 |
| ·SHMT的最适作用pH | 第83-84页 |
| ·SHMT的最适作用温度 | 第84页 |
| ·pH值对SHMT酶活稳定性的影响 | 第84-85页 |
| ·温度对SHMT酶活稳定性的影响 | 第85页 |
| ·小结 | 第85-86页 |
| 第四章 突变体MB200gTB与工程菌MB202的构建及其产L-丝氨酸的研究 | 第86-105页 |
| ·构建MB200 glyA基因的突变体 | 第87-88页 |
| ·突变体分析 | 第88-89页 |
| ·突变体的生长情况分析 | 第88-89页 |
| ·突变体的SHMT酶活检测 | 第89页 |
| ·突变体产L-丝氨酸分析 | 第89页 |
| ·构建工程菌MB202 | 第89-90页 |
| ·菌株的酶活性分析 | 第90-92页 |
| ·野生型菌株、突变体及重组菌中SHMT、HPR与SGAT的酶活分析 | 第90-91页 |
| ·不同生长时期中菌株MB200与MB202的SHMT酶活 | 第91-92页 |
| ·静息细胞产L-丝氨酸及其条件优化 | 第92-97页 |
| ·pn对产L—丝氨酸的影响 | 第93-94页 |
| ·温度对L-丝氨酸生成的影响 | 第94-95页 |
| ·甘氨酸对L-丝氨酸生成的影响 | 第95页 |
| ·甲醇对L-丝氨酸生成的影响 | 第95-96页 |
| ·菌体密度对L-丝氨酸生成的影响 | 第96-97页 |
| ·正交实验设计 | 第97-100页 |
| ·固定化MB202细胞产L-丝氨酸 | 第100-104页 |
| ·固定化材料的选择 | 第100-101页 |
| ·固定化细胞产L—丝氨酸条件的优化 | 第101-104页 |
| ·海藻酸钠浓度对L-丝氨酸产量的影响 | 第101-102页 |
| ·氯化钙浓度对L-丝氨酸产量的影响 | 第102页 |
| ·固定化时间对L-丝氨酸产量的影响 | 第102-103页 |
| ·包埋的菌体量对L-丝氨酸产量的影响 | 第103-104页 |
| ·小结 | 第104-105页 |
| 第五章 羟基丙酮酸还原酶基因(hpr)的克隆、研究与应用 | 第105-123页 |
| ·hpr基因的克隆 | 第105-106页 |
| ·hpr基因序列分析 | 第106-109页 |
| ·突变体的构建 | 第109-111页 |
| ·三亲本结合 | 第110页 |
| ·突变体的验证 | 第110-111页 |
| ·互补菌株MB200hHB和工程菌株MB201的构建 | 第111-113页 |
| ·突变体、互补株、重组菌株的生长情况分析 | 第113-116页 |
| ·碳源利用情况 | 第113-114页 |
| ·生长曲线测定 | 第114-115页 |
| ·菌株的酶活性分析 | 第115-116页 |
| ·hpr基因在大肠杆菌中的表达 | 第116-120页 |
| ·表达载体的构建及诱导表达 | 第116-117页 |
| ·酶学分析的初步分析 | 第117-120页 |
| ·重组菌株MB201产乙醛酸 | 第120-121页 |
| ·乙醛酸的HPLC分析 | 第120-121页 |
| ·乙醛酸积累与菌株生长周期的关系 | 第121页 |
| ·小结 | 第121-123页 |
| 第六章 总结与讨论 | 第123-129页 |
| ·关于glyA基因的研究 | 第123-124页 |
| ·静息细胞产L-丝氨酸 | 第124页 |
| ·关于hpr基因的研究 | 第124-125页 |
| ·发酵法产乙醛酸 | 第125-126页 |
| ·其它相关研究 | 第126-127页 |
| ·本研究的创新点 | 第127页 |
| ·后续研究 | 第127-128页 |
| ·结束语 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第139页 |
