| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-8页 |
| 第一章 前言 | 第8-15页 |
| ·乳酸的功能及目前主要生产方法 | 第8-9页 |
| ·大肠杆菌的代谢途径分析 | 第9-10页 |
| ·基因敲除简介 | 第10-12页 |
| ·噬菌体∧的RED重组系统原理 | 第12-14页 |
| ·本研究的目的 | 第14-15页 |
| 第二章 利用RED重组系统来对大肠杆菌乙醇脱氢酶(ADHE)、D—乳酸脱氢酶(LDH)、乙酸激酶(ACKA)进行敲除 | 第15-30页 |
| ·实验材料 | 第15-16页 |
| ·菌株与质粒 | 第15页 |
| ·酶与试剂 | 第15页 |
| ·主要仪器设备 | 第15-16页 |
| ·方法与步骤 | 第16-25页 |
| ·大肠杆菌BW25113/pKD46、pKD3、pKD4、peP20复苏培养 | 第16页 |
| ·大肠杆菌BW25113/pKD46、pKD3、pKD4、pCP20菌种的保存 | 第16页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第16-17页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第17-18页 |
| ·Escherichia coli基因组总DNA的制备 | 第18页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第18-19页 |
| ·DNA的酶切与连接 | 第19页 |
| 2,2.8 连接产物化学法转化大肠杆菌感受态细胞 | 第19页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第19-20页 |
| ·PCR引物设计和扩增条件 | 第20-22页 |
| ·电击感受态细胞的制备和电击转化 | 第22-23页 |
| ·筛选和PCR的验证原理 | 第23-24页 |
| ·抗性基因的消除 | 第24-25页 |
| ·结果和分析 | 第25-29页 |
| ·BW25113A(△adhE∷Cm),BW25113B(△adhE∷FRT)adhE缺失突变体的PCR验证 | 第25-26页 |
| ·BW25113C(△adhE∷FRT,△ldhA∷Kam),BW25113D(△adhE∷FRT,△ldhA∷FRT)ldhA缺失突变体的PCR验证 | 第26-27页 |
| ·对BW25113D的ldhA的完全序列分析 | 第27-28页 |
| ·BW25113ackA缺失突变体的PCR验证 | 第28-29页 |
| ·讨论 | 第29-30页 |
| ·同源臂间距对重组效率的影响 | 第29页 |
| ·提高电转化效率的方法 | 第29-30页 |
| 第三章 质粒PSE380-LDH在BW25113D菌株中的表达、酶活测定及L-乳酸的检测 | 第30-39页 |
| ·实验材料 | 第30页 |
| ·方法和步骤 | 第30-33页 |
| ·pSE-380-ldh电转化到BW25113D突变体中 | 第30页 |
| ·外源片段在大肠杆菌BW25113D中的诱导表达 | 第30页 |
| ·表达产物的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第30-31页 |
| ·大肠杆菌细胞的破碎 | 第31页 |
| ·乳酸脱氢酶活力的测定 | 第31-33页 |
| ·结果和分析 | 第33-34页 |
| ·BW25113D/pSE-380-ldh的表达产物的SDS-PAGE电泳分析 | 第33-34页 |
| ·L-乳酸脱氢酶酶活的测定 | 第34页 |
| ·酶学特性的研究 | 第34-36页 |
| ·大肠杆菌BW25113、BW25113D的生长曲线 | 第36-37页 |
| ·BW25113D/pSE-1dhL发酵培养及L-乳酸的检测 | 第37-38页 |
| ·讨论 | 第38-39页 |
| 第四章 结论和展望 | 第39-41页 |
| ·结论 | 第39-40页 |
| ·问题与展望 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-46页 |
| 附录 | 第46-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第53页 |
