| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 1 引言 | 第9-13页 |
| ·研究意义 | 第9页 |
| ·蛋白质激酶研究进展 | 第9-10页 |
| ·体外表达系统 | 第10-13页 |
| 2 材料与方法 | 第13-32页 |
| ·试验材料 | 第13-18页 |
| ·质粒和菌株 | 第13页 |
| ·主要试剂及用品 | 第13页 |
| ·仪器与设备 | 第13-14页 |
| ·试剂配制 | 第14-18页 |
| ·酿酒酵母菌转化培养液配制 | 第14页 |
| ·酿酒酵母诱导表达培养液配制 | 第14页 |
| ·细菌培养基制备 | 第14-15页 |
| ·毕赤酵母表达常用母液及缓冲液配制 | 第15-16页 |
| ·毕赤酵母表达培养基配制 | 第16页 |
| ·冻融法制备毕赤酵母基因组DNA | 第16-17页 |
| ·Western Blot所用试剂 | 第17-18页 |
| ·试验方法 | 第18-32页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第18-23页 |
| ·寡核苷酸引物的设计合成及PCR产物扩增 | 第18-19页 |
| ·第一次PCR产物纯化 | 第19页 |
| ·第二次PCR | 第19-20页 |
| ·第二次PCR产物纯化 | 第20页 |
| ·酿酒酵母转化及重组子的验证 | 第20-22页 |
| ·诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第22页 |
| ·Western检测 | 第22-23页 |
| ·激酶自我磷酸化活性检测 | 第23页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第23-32页 |
| ·寡核苷酸引物的设计合成 | 第23-24页 |
| ·Xa21和Pi-d2激酶区序列的PCR扩增及纯化 | 第24页 |
| ·PCR产物纯化 | 第24页 |
| ·载体和目的片断的酶切与连接反应 | 第24-26页 |
| ·连接产物的转化 | 第26页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第26-27页 |
| ·重组质粒的测序分析 | 第27页 |
| ·转化毕赤酵母 | 第27-28页 |
| ·用PCR方法验证重组载体 | 第28页 |
| ·重组基因在酵母中的小量诱导表达 | 第28-29页 |
| ·重组基因在酵母中诱导表达培养条件优化 | 第29-30页 |
| ·不同浓缩方法浓缩蛋白质 | 第30页 |
| ·表达产物的分析与鉴定 | 第30-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-47页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第32-35页 |
| ·目的基因的扩增 | 第32页 |
| ·第二次PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·转化酿酒酵母及PCR验证转化子 | 第33-34页 |
| ·蛋白质诱导表达及Western检测 | 第34页 |
| ·激酶自我磷酸化活性检测 | 第34-35页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第35-47页 |
| ·目的基因的扩增 | 第35页 |
| ·重组载体构建的鉴定 | 第35-37页 |
| ·重组载体的测序及结果分析 | 第37页 |
| ·MD平板筛选重组转化子 | 第37页 |
| ·YPD-G418或YPD-Zeocin筛选高拷贝重组转化子 | 第37-38页 |
| ·PCR鉴定重组转化子 | 第38-41页 |
| ·SDS-PAGE检测目的蛋白质表达及鉴定 | 第41-43页 |
| ·Western Blot检测目的蛋白质表达 | 第43-47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第47页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第47-49页 |
| 5 结论 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-53页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第53-54页 |
| 作者简历 | 第54-55页 |
| 致谢 | 第55页 |