| 致谢 | 第1-8页 |
| 表格目录 | 第8页 |
| LIST OF TABLES | 第8-9页 |
| 插图目录 | 第9-10页 |
| LIST OF FIGURES | 第10-12页 |
| 摘要 | 第12-14页 |
| ABSRTRACT | 第14-16页 |
| 第一章：侵染半夏的大豆花叶病毒株系的概述 | 第16-29页 |
| 1 寄主范围和症状表现 | 第16-18页 |
| 2 病毒粒子形态学和细胞病理学特征 | 第18-19页 |
| 3 血清学 | 第19页 |
| 4 SMV-P的基因组结构 | 第19-20页 |
| 5 SMV-P编码的蛋白 | 第20页 |
| 6 SMV-P编码蛋白的功能 | 第20-26页 |
| ·P1蛋白的功能 | 第20-22页 |
| ·HC-Pro的功能 | 第22-23页 |
| ·P3蛋白的功能 | 第23页 |
| ·6K1和6K2蛋白的功能 | 第23-24页 |
| ·CI蛋白的功能 | 第24页 |
| ·NIa-VPg的功能 | 第24页 |
| ·NIa-Pro的功能 | 第24-25页 |
| ·NIb蛋白的功能 | 第25页 |
| ·CP蛋白的功能 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-29页 |
| 第二章：与大豆花叶病毒相关的半夏病毒P1基因的变异、原核表达及抗血清制备 | 第29-48页 |
| 材料与方法 | 第29-39页 |
| 1 实验材料 | 第29-30页 |
| ·病样 | 第29-30页 |
| ·菌株与载体质粒 | 第30页 |
| ·试剂与试剂盒 | 第30页 |
| ·引物 | 第30页 |
| 2 实验方法 | 第30-39页 |
| ·半夏叶片总RNA的提取 | 第30-31页 |
| ·逆转录合成cDNA第一链 | 第31页 |
| ·马铃薯Y病毒科简并引物检测病毒 | 第31页 |
| ·P1基因的PCR扩增 | 第31-32页 |
| ·PCR产物的检测 | 第32页 |
| ·T-A连接 | 第32页 |
| ·质粒转化宿主菌 | 第32-33页 |
| ·感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第32-33页 |
| ·转化 | 第33页 |
| ·碱裂法提取重组质粒 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第34页 |
| ·序列测定及分析 | 第34页 |
| ·原核表达载体pGEX-(SMV-P)P1的构建 | 第34-35页 |
| ·目的基因片段的获得 | 第34页 |
| ·目的基因片段与表达载体的连接 | 第34-35页 |
| ·连接产物的转化 | 第35页 |
| ·SMV-P P1蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第35-36页 |
| ·蛋白的诱导表达 | 第35页 |
| ·12％ SDS-PAGE检测 | 第35-36页 |
| ·抗血清制备 | 第36-38页 |
| ·诱导表达融合蛋白并收集菌体 | 第36页 |
| ·SDS-PAGE纯化目的蛋白 | 第36-37页 |
| ·免疫小鼠 | 第37页 |
| ·抗血清的处理 | 第37-38页 |
| ·Western blot检测抗血清 | 第38-39页 |
| 结果与分析 | 第39-46页 |
| 1 马铃薯Y病毒科的简并引物检测病毒 | 第39-40页 |
| 2 PCR扩增SMV的P1基因 | 第40页 |
| 3 PCR扩增SMV-P的P1基因 | 第40-41页 |
| 4 构建pGEM-(SMV-P)P1重组质粒 | 第41-42页 |
| 5 SMV-P P1基因的序列测定与分析 | 第42-43页 |
| 6 原核表达载体pGEX-(SMV-P)P1的构建 | 第43-44页 |
| 7 SMV-P P1基因原核表达产物的SDS-PAGE分析 | 第44-45页 |
| 8 Western blot检测SMV-P P1蛋白的抗血清 | 第45-46页 |
| 讨论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-48页 |
| 第三章 在酵母中表达与大豆花叶病毒相关的半夏病毒P1基因及半夏酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选 | 第48-72页 |
| 材料与方法 | 第49-61页 |
| 1 实验材料 | 第49-50页 |
| ·菌株与质粒 | 第49页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第49-50页 |
| ·引物 | 第50页 |
| 2 实验方法 | 第50-61页 |
| ·酵母菌株的活化 | 第50-51页 |
| ·酵母表型鉴定 | 第51页 |
| ·酵母双杂交载体pGBKT7-(SMV-P)P1的构建与表达 | 第51-55页 |
| ·酵母双杂交载体pGBKT7-(SMV-P)P1的构建 | 第51-52页 |
| ·目的基因的获得 | 第51-52页 |
| ·SMV-P P1基因片段与酵母双杂交载体pGBKT7的连接和转化TG1 | 第52页 |
| ·酵母双杂交载体pGBKT7-(SMV-P)P1电击法转化酵母AH109 | 第52-53页 |
| ·酵母感受态细胞制备 | 第52页 |
| ·电击转化 | 第52-53页 |
| ·DNA-BD／(SMV-P)P1融合蛋白的自激活排除 | 第53页 |
| ·DNA-BD／(SMV-P)P1融合蛋白对酵母菌AH109的毒性检测 | 第53-54页 |
| ·DNA-BD／(SMV-P)P1融合蛋白的表达 | 第54-55页 |
| ·酵母总蛋白抽提(尿素／SDS法) | 第54页 |
| ·Western blot检测融合蛋白表达 | 第54-55页 |
| ·半夏酵母双杂交cDNA文库的构建 | 第55-59页 |
| ·半夏总RNA的提取与检测 | 第55-56页 |
| ·Trizol法提取总RNA | 第55页 |
| ·RNA样品OD值检测 | 第55-56页 |
| ·RNA电泳检测 | 第56页 |
| ·第一链cDNA合成 | 第56页 |
| ·LD PCR合成和扩增ds cDNA | 第56-57页 |
| ·酵母感受态细胞制备(LiAc法) | 第57-58页 |
| ·ds cDNA和pGADT7-Rec共转化酵母菌株 | 第58页 |
| ·收获文库菌 | 第58页 |
| ·文库质量检测 | 第58-59页 |
| ·文库的独立克隆数 | 第58-59页 |
| ·文库滴度 | 第59页 |
| ·文库质粒插入片段长度检测 | 第59页 |
| ·文库筛选 | 第59-61页 |
| ·酵母Mating筛选 | 第59页 |
| ·接合产物涂平板 | 第59-60页 |
| ·阳性克隆的初步鉴定 | 第60页 |
| ·阳性克隆的进一步确证 | 第60-61页 |
| ·阳性克隆质粒的自激活检测 | 第60页 |
| ·回复杂交 | 第60-61页 |
| ·阳性克隆质粒与空载体pGBKT7共转化AH109 | 第61页 |
| ·阳性克隆质粒与pGBKT7-lam共转化AH109 | 第61页 |
| ·文库质粒测序 | 第61页 |
| 结果与分析 | 第61-68页 |
| 1 酵母菌株表型鉴定结果 | 第61-62页 |
| 2 “诱饵”质粒pGBKT7-(SMV-P)P1的构建及其在酵母中的表达检测 | 第62-63页 |
| ·重组质粒pGBKT7-(SMV-P)P1的鉴定 | 第62页 |
| ·DNA-BD／(SMV-P)P1融合蛋白的自激活排除 | 第62页 |
| ·DNA-BD／(SMV-P)P1融合蛋白对酵母菌AH109的毒性检测 | 第62-63页 |
| ·酵母双杂交载体pGBKT7-(SMV-P)P1在酵母菌AH109中的表达 | 第63页 |
| 3 半夏酵母双杂交cDNA文库构建 | 第63-66页 |
| ·半夏总RNA的质量评定 | 第63-64页 |
| ·双链cDNA的合成 | 第64-65页 |
| ·cDNA文库的构建及质量鉴定 | 第65-66页 |
| ·文库独立克隆数 | 第65页 |
| ·文库滴度 | 第65页 |
| ·PCR检测文库质粒插入片段长度 | 第65-66页 |
| 4 半夏cDNA文库的筛选 | 第66-67页 |
| ·文库菌Y187与AH109／pGBKT7-(SMV-P)P1的接合效率 | 第66页 |
| ·阳性克隆的初步筛选 | 第66页 |
| ·阳性克隆的进一步验证 | 第66-67页 |
| 5 测序结果与分析 | 第67-68页 |
| 讨论 | 第68-71页 |
| 参考文献 | 第71-72页 |
| 第四章：与大豆花叶病毒相关的半夏病毒6K1基因的原核表达、抗血清制备及免疫胶体金标记 | 第72-81页 |
| 材料与方法 | 第73-74页 |
| 1 实验材料 | 第73页 |
| ·菌株与载体质粒 | 第73页 |
| ·试剂与试剂盒 | 第73页 |
| ·引物 | 第73页 |
| 2 实验方法 | 第73-74页 |
| ·原核表达载体pGEX-(SMV-P)6K1的构建 | 第73-74页 |
| ·SMV-P 6K1蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第74页 |
| ·抗血清制备 | 第74页 |
| ·Western blot检测抗血清 | 第74页 |
| ·免疫胶体金标记半夏中的SMV-P 6K1蛋白 | 第74页 |
| 结果与分析 | 第74-80页 |
| 1 6K1基因的获得 | 第74-75页 |
| 2 原核表达载体pGEX-(SMV-P)6K1的构建 | 第75-76页 |
| 3 SMV-P 6K1基因原核表达产物的SDS-PAGE分析 | 第76-77页 |
| 4 Western blot检测SMV-P 6K1蛋白的抗血清 | 第77-78页 |
| 5 免疫胶体金标记半夏病叶中的6K1蛋白 | 第78-80页 |
| 讨论 | 第80页 |
| 参考文献 | 第80-81页 |
| 第五章：主要结论与进一步研究的建议 | 第81-83页 |
| 1 主要结论 | 第81-82页 |
| 2 进一步研究建议 | 第82-83页 |
