| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-13页 |
| 第一章 正链RNA病毒起始RNA合成的分子机制 | 第13-26页 |
| ·正链RNA病毒基因组RNA结构与复制的多样性 | 第13-15页 |
| ·病毒复制酶或RNA依赖的RNA聚合酶 | 第15-17页 |
| ·正链RNA病毒起始RNA合成的机制 | 第17-21页 |
| ·引物依赖的RNA合成 | 第17-20页 |
| ·引物非依赖从头RNA合成 | 第20-21页 |
| ·病毒可以利用一种或两种机制起始RNA合成 | 第21-22页 |
| ·反应条件对起始RNA合成机制的影响 | 第22-23页 |
| ·金属离子 | 第22页 |
| ·温度 | 第22页 |
| ·模板与酶量 | 第22页 |
| ·5’帽子结构 | 第22-23页 |
| ·模板起始核苷酸(T+1)与起始三磷酸核苷酸(NTPi) | 第23-24页 |
| ·起始RNA合成复合体 | 第24-25页 |
| ·问题与展望 | 第25-26页 |
| 第二章 猪瘟病毒的分子生物学研究进展 | 第26-36页 |
| ·概述 | 第26-28页 |
| ·猪瘟病毒编码基因的研究进展 | 第28-32页 |
| ·结构蛋白的研究 | 第28-29页 |
| ·非结构蛋白研究 | 第29-32页 |
| ·非编码区的研究进展 | 第32-35页 |
| ·5’UTR | 第32-33页 |
| ·3’UTR | 第33-35页 |
| ·本研究的背景与目的 | 第35-36页 |
| 第三章 猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因的克隆、表达与纯化 | 第36-56页 |
| ·材料与方法 | 第36-44页 |
| ·病毒、菌株、载体和试剂 | 第36-37页 |
| ·血毒中总RNA提取 | 第37页 |
| ·RT-PCR反应 | 第37-38页 |
| ·PCR产物回收纯化并克隆到pGEM-T载体 | 第38页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第38-40页 |
| ·定点突变 | 第40-41页 |
| ·RNA依赖RNA聚合酶的诱导表达 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE和蛋白免疫印迹 | 第41-42页 |
| ·RNA依赖RNA聚合酶的亲和纯化 | 第42页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第42-43页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第43页 |
| ·序列比较分析与蛋白三级结构预测 | 第43-44页 |
| ·结果 | 第44-53页 |
| ·RNA依赖的RNA聚合酶基因的扩增及其序列分析 | 第44-47页 |
| ·原核表达载体的构建及酶切鉴定 | 第47-49页 |
| ·RNA依赖的RNA聚合酶在大肠杆菌中的诱导表达 | 第49-50页 |
| ·RNA依赖RNA聚合酶的亲和纯化与鉴定 | 第50-52页 |
| ·纯化蛋白的浓度测定 | 第52页 |
| ·CSFVRNA依赖的RNA聚合酶的三级结构预测 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-56页 |
| 第四章 猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始病毒正链和负链RNA合成的分子机制 | 第56-82页 |
| ·材料与方法 | 第56-62页 |
| ·实验材料与试剂 | 第56-57页 |
| ·正链和负链DNA模板以及突变模板的PCR扩增 | 第57-58页 |
| ·体外转录 | 第58-59页 |
| ·RNA模板的变性PAGE纯化 | 第59页 |
| ·3’-OH封闭的RNA模板制备 | 第59页 |
| ·RNA探针的制备 | 第59页 |
| ·银染 | 第59-60页 |
| ·体外RdRp反应 | 第60页 |
| ·RT-PCR | 第60页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第60-61页 |
| ·Northern blot分析 | 第61-62页 |
| ·结果 | 第62-75页 |
| ·病毒正链和负链DNA模板的扩增与RNA模板的制备 | 第62-63页 |
| ·荧光定量PCR标准曲线的制作 | 第63-64页 |
| ·纯化蛋RNA依赖的RNA聚合酶活性的检测 | 第64-65页 |
| ·CSFV RdRp起始正链和负链RNA合成的分子机制 | 第65-71页 |
| ·Mg~(2+)和Mn~(2+)对起始RNA合成的影响 | 第71-72页 |
| ·反应条件对从头RNA合成的影响 | 第72-73页 |
| ·高浓度的NTP预孵育对起始RNA合成的影响 | 第73-74页 |
| ·CSFV RdRp优先利用模板3’末端胞嘧啶作起始核苷酸(T_(+1)) | 第74-75页 |
| ·讨论 | 第75-82页 |
| ·NS5BΔ24仍然具有RNA依赖的RNA聚合酶活性 | 第75-76页 |
| ·CSFV RdRp从头起始RNA合成的证据 | 第76-77页 |
| ·CSFV RdRp能以模板转换的方式起始正链RNA合成 | 第77-78页 |
| ·对RdRp末端转移酶活性以及不同研究结果的可能解释 | 第78-81页 |
| ·RNA模板3’末端胞嘧啶对起始RNA合成的重要性 | 第81-82页 |
| 第五章 猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶与病毒正链、负链RNA模板特异性结合及RdRp亚细胞定位的研究 | 第82-95页 |
| ·材料与方法 | 第82-86页 |
| ·菌株、载体、细胞和试剂 | 第82-83页 |
| ·非标记RNA模板与DIG标记RNA模板的制备 | 第83页 |
| ·蛋白质的复性及North-Western blot | 第83页 |
| ·模板竞争试验 | 第83-84页 |
| ·CSFV全长和截短的RdRp真核表达载体的构建 | 第84-86页 |
| ·细胞转染 | 第86页 |
| ·结果 | 第86-94页 |
| ·CSFV RdRp与病毒正链、负链RNA模板之间结合的研究 | 第86-87页 |
| ·RdRp与病毒正链和负链模板的特异性结合 | 第87-89页 |
| ·真核表达质粒的酶切或PCR鉴定 | 第89-90页 |
| ·全长RdRp与截短的RdRp在细胞中的定位 | 第90-92页 |
| ·C末端疏水氨基酸可能是膜锚定序列 | 第92-94页 |
| ·讨论 | 第94-95页 |
| 第六章 猪瘟病毒NS5A蛋白原核表达与亚细胞定位的研究 | 第95-105页 |
| ·材料与方法 | 第95-99页 |
| ·细菌、细胞、载体和试剂 | 第95页 |
| ·NS5A基因的扩增及原核表达载体的构建 | 第95-97页 |
| ·5A-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE | 第97-98页 |
| ·瞬时表达质粒的构建 | 第98页 |
| ·重组质粒转染细胞 | 第98-99页 |
| ·结果与讨论 | 第99-105页 |
| ·NS5A基因的PCR扩增与序列分析 | 第99-101页 |
| ·pGEX-5A和pET-5A原核表达载体的构建与鉴定 | 第101页 |
| ·NS5A蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第101-102页 |
| ·瞬时表达载体p5A-EGFP的酶切鉴定 | 第102-103页 |
| ·5A-GFP融合蛋白在PK-15细胞中的定位 | 第103-105页 |
| 研究总结 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-122页 |
| 附录 | 第122-124页 |
| 在读期间发表的文章 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125页 |
