| 摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-21页 |
| 综述 | 第21-50页 |
| 一: 乙酰肝素酶的结构、功能及调控 | 第21-35页 |
| 摘要 | 第21页 |
| 关键词 | 第21-22页 |
| 前言 | 第22页 |
| 乙酰肝素酶的发现 | 第22-23页 |
| 乙酰肝素酶的分子特性 | 第23-25页 |
| 乙酰肝素酶的基因定位及转录 | 第25-26页 |
| 乙酰肝素酶基因的表达调控 | 第26页 |
| 乙酰肝素酶的功能 | 第26-28页 |
| 乙酰肝素酶的亚细胞定位及活性调控 | 第28-30页 |
| 结语 | 第30页 |
| 参考文献 | 第30-35页 |
| 二: 乙酰肝素酶的分子特性及其在生理病理过程中的作用 | 第35-50页 |
| 摘要 | 第35页 |
| 关键词 | 第35-36页 |
| 前言 | 第36-37页 |
| 乙酰肝素酶在血管生成中的作用 | 第37-38页 |
| 乙酰肝素酶在炎症中的作用 | 第38-39页 |
| 乙酰肝素酶在胚胎和组织发育中的作用 | 第39-40页 |
| 乙酰肝素酶在肿瘤浸润、转移过程中的作用 | 第40-41页 |
| 乙酰肝素酶在恶性肿瘤中表达的调控 | 第41-43页 |
| 乙酰肝素酶的抑制剂及其临床前景 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-50页 |
| 引言 | 第50-53页 |
| 第一章 乙酰肝素酶的基因分离及其在真核细胞中的表达 | 第53-85页 |
| 摘要 | 第53-54页 |
| 关键词 | 第54页 |
| 前言 | 第54-55页 |
| 1 实验材料 | 第55-58页 |
| ·菌株、细胞株和质粒 | 第55页 |
| ·培养基 | 第55-56页 |
| ·工具酶 | 第56页 |
| ·化学试剂 | 第56页 |
| ·试剂盒 | 第56页 |
| ·主要溶液 | 第56-58页 |
| 2 实验仪器 | 第58-59页 |
| 3 方法 | 第59-72页 |
| ·从HepG2细胞中提取mRNA | 第59-61页 |
| ·细胞的复苏 | 第59页 |
| ·细胞的传代 | 第59页 |
| ·细胞的冻存 | 第59-60页 |
| ·RNA提取 | 第60-61页 |
| ·RT-PCR扩增目的基因 | 第61-62页 |
| ·反转录 | 第61页 |
| ·PCR扩增乙酰肝素酶基因全序列 | 第61-62页 |
| ·将PCR产物直接克隆入pGEM-T载体 | 第62-65页 |
| ·PCR产物的纯化回收 | 第62页 |
| ·DNA的定量 | 第62-63页 |
| ·外源DNA与质粒载体的连接反应 | 第63页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第63-64页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第63-64页 |
| ·连接产物的转化反应 | 第64页 |
| ·阳性亚克隆重组子的筛选 | 第64页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第64-65页 |
| (1) PCR法鉴定 | 第64-65页 |
| (2) 酶切方法鉴定 | 第65页 |
| (3) 测序方法鉴定 | 第65页 |
| ·构建载体 | 第65-68页 |
| ·乙酰肝素酶基因全长的扩增 | 第65-66页 |
| ·不含信号肽序列的乙酰肝素酶基因的扩增 | 第66页 |
| ·PCR产物及载体的纯化，酶切，连接 | 第66-67页 |
| ·连接产物转化TOP10感受态细胞 | 第67页 |
| ·阳性克隆的筛选和鉴定 | 第67-68页 |
| (1) PCR法鉴定 | 第67页 |
| (2) 酶切方法鉴定 | 第67-68页 |
| (3) 测序方法鉴定 | 第68页 |
| ·转染COS-7细胞 | 第68页 |
| ·细胞的收集和抽提 | 第68页 |
| ·目的蛋白表达的检测 | 第68-71页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第68-70页 |
| ·转膜 | 第70页 |
| ·Western-blot | 第70页 |
| ·显色 | 第70-71页 |
| ·筛选恒定表达细胞株 | 第71-72页 |
| ·测定zeocin的最低敏感浓度 | 第71页 |
| ·转染CHO细胞 | 第71页 |
| ·筛选恒定表达细胞株 | 第71-72页 |
| ·恒定表达乙酰肝素酶细胞株的鉴定 | 第72页 |
| ·RT-PCR法鉴定 | 第72页 |
| ·目的蛋白表达的检测 | 第72页 |
| 4 结果 | 第72-83页 |
| ·分离乙酰肝素酶基因 | 第72-73页 |
| ·乙酰肝素酶基因的全序列测定 | 第73-74页 |
| ·乙酰肝素酶基因的全序列的同源性分析 | 第74-79页 |
| ·乙酰肝素酶全序列和不含信号肽序列PCR扩增产物的测定 | 第79页 |
| ·重组质粒的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第79-80页 |
| ·重组质粒的序列测定结果 | 第80页 |
| ·酰肝素酶在COS-7细胞中的瞬时表达 | 第80-81页 |
| ·Zeocin最低敏感度的测定 | 第81-82页 |
| ·CHO恒定表达细胞株中乙酰肝素酶mRNA的检测 | 第82页 |
| ·CHO恒定表达细胞株中乙酰肝素酶蛋白的检测 | 第82-83页 |
| 5 讨论 | 第83-85页 |
| 第二章 乙酰肝素酶大小亚基在大肠杆菌中的融合表达 | 第85-111页 |
| 摘要 | 第85页 |
| 关键词 | 第85页 |
| 前言 | 第85-87页 |
| 1 材料 | 第87-89页 |
| ·菌株和质粒 | 第87页 |
| ·培养基 | 第87页 |
| ·工具酶 | 第87页 |
| ·化学试剂 | 第87-88页 |
| ·试剂盒 | 第88页 |
| ·主要溶液 | 第88-89页 |
| 2 实验仪器 | 第89-90页 |
| 3 方法 | 第90-95页 |
| ·PCR扩增乙酰肝素酶50KD大亚基基因序列 | 第90-91页 |
| ·PCR扩增乙酰肝素酶8KD小亚基基因序列 | 第91页 |
| ·构建载体 | 第91-92页 |
| ·阳性亚克隆重组子的筛选和鉴定 | 第92页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第92-93页 |
| ·表达菌株的筛选 | 第92页 |
| ·表达产物的可溶性分析 | 第92页 |
| ·诱导条件的优化 | 第92-93页 |
| ·诱导温度对表达的影响 | 第92-93页 |
| ·诱导时间对表达的影响 | 第93页 |
| ·诱导剂IPTG的浓度对表达的影响 | 第93页 |
| ·宿主菌对表达的影响 | 第93页 |
| ·挑选表达量高的工程菌株进行发酵培养 | 第93-94页 |
| ·活化菌种，准备种子液 | 第93页 |
| ·发酵 | 第93-94页 |
| ·包涵体蛋白的溶解，重折叠及纯化 | 第94-95页 |
| ·破菌 | 第94页 |
| ·洗涤包含体 | 第94页 |
| ·溶解包涵体 | 第94页 |
| ·包涵体蛋白的重折叠 | 第94-95页 |
| ·离子交换层析 | 第95页 |
| ·免疫亲和层析 | 第95页 |
| 4 结果 | 第95-109页 |
| ·乙酰肝素酶50KD大亚基基因序列的扩增 | 第95-96页 |
| ·重组质粒pGEX-2TK-50KD的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第96-97页 |
| ·重组质粒PGEX-2TK 50KD的序列测定结果 | 第97-98页 |
| ·乙酰肝素酶8KD大亚基基因序列的扩增 | 第98页 |
| ·重组质粒PGEX-2TK 8KD的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第98-99页 |
| ·重组质粒PGEX-2TK 8KD序列测定结果 | 第99-100页 |
| ·表达质粒pGEX-2TK-50KD在大肠杆菌中的表达 | 第100页 |
| ·表达质粒pGEX-2TK-8KD在大肠杆菌中的表达 | 第100-101页 |
| ·表达产物的western blot分析 | 第101-102页 |
| ·8KD小亚基融合蛋白在不同温度诱导下的表达形式 | 第102页 |
| ·8KD小亚基融合蛋白在不同宿主菌中的表达 | 第102-103页 |
| ·诱导时间对目的蛋白表达的影响 | 第103-104页 |
| ·诱导剂IPTG的浓度对目的蛋白表达的影响 | 第104-105页 |
| ·发酵期间菌体的生长情况 | 第105-106页 |
| ·发酵产物的SDS-PAGE电泳分析 | 第106-107页 |
| ·包涵体洗涤的SDS-PAGE电泳分析 | 第107页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第107-109页 |
| ·目的蛋白的离子交换层析 | 第107-108页 |
| ·目的蛋白的免疫纯化层析 | 第108-109页 |
| 5 讨论 | 第109-111页 |
| 第三章 乙酰肝素酶大小亚基相互作用蛋白的研究 | 第111-133页 |
| 摘要 | 第111页 |
| 前言 | 第111-112页 |
| 1 材料 | 第112-116页 |
| ·菌株、质粒和文库 | 第112-113页 |
| ·培养基 | 第113页 |
| ·工具酶 | 第113页 |
| ·化学试剂 | 第113页 |
| ·试剂盒 | 第113-114页 |
| ·主要溶液 | 第114-116页 |
| ·培养基 | 第114页 |
| ·酵母质粒和蛋白提取溶液 | 第114-115页 |
| ·SDS-PAGE所需试剂 | 第115页 |
| ·Western blot所需试剂 | 第115-116页 |
| 2 实验仪器 | 第116-117页 |
| 3 方法 | 第117-126页 |
| ·PCR扩增乙酰肝素酶50KD大亚基基因序列 | 第117页 |
| ·诱饵蛋白表达载体构建 | 第117-118页 |
| ·阳性亚克隆重组子的筛选和鉴定 | 第118页 |
| ·酵母感受态的制备 | 第118页 |
| ·酵母小规模转化 | 第118-119页 |
| ·酵母双杂交系统正确性检验 | 第119页 |
| ·酵母的长期保存与复苏 | 第119页 |
| ·诱饵蛋白的表达检测(尿素／SDS法) | 第119-120页 |
| ·小规模酵母杂交实验 | 第120页 |
| ·杂交效率的计算 | 第120-121页 |
| ·文库的杂交筛选 | 第121-122页 |
| ·酵母质粒提取 | 第122页 |
| ·电转化大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第122-123页 |
| ·酵母中提取的质粒电转化入大肠杆菌JM109 | 第123-124页 |
| ·阳性pGADT7-Rec质粒的筛选鉴定 | 第124页 |
| ·在酵母中相互作用的再次确证 | 第124页 |
| ·核酸序列分析和同源性分析 | 第124-125页 |
| ·酵母双杂交实验流程 | 第125-126页 |
| 4 结果 | 第126-132页 |
| ·乙酰肝素酶50KD大亚基基因序列的扩增 | 第126页 |
| ·重组质粒pGBKT7-50KD HPA的PCR和酶切鉴定 | 第126-127页 |
| ·重组质粒pGBKT7-50KD HPA的序列测定结果 | 第127页 |
| ·酵母菌株AH109的表型鉴定结果 | 第127页 |
| ·阳性和阴性对照质粒的鉴定结果 | 第127-128页 |
| ·x-α-gal显色反应 | 第128页 |
| ·诱饵蛋白质粒配pGBKT7-50KD HPA转录活性的分析 | 第128页 |
| ·诱饵蛋白的表达分析 | 第128-129页 |
| ·杂交效率的计算结果 | 第129页 |
| ·小规模文库杂交结果 | 第129页 |
| ·文库杂交结果 | 第129页 |
| ·核酸序列分析和同源性检索 | 第129-131页 |
| ·相互作用的再次确证 | 第131-132页 |
| 5 讨论 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-138页 |
| 附图 | 第138-158页 |
| 英文缩写词表 | 第158-160页 |
| 博士生期间发表的论文和著作 | 第160-163页 |
| 论文 | 第160-162页 |
| 著作 | 第162-163页 |
| 致谢 | 第163页 |
